La méthode classique dans laquelle les protéines membranaires sont extraites pour leur étude est par solubilisation simple dans le détergent. Bien qu’il s’agit d’une méthode simple et universelle, il a été démontré que les détergents modifient la structure, la fonction et l’activité indigènes de ces protéines sensibles. Ici, nous présentons le Peptidisc comme une solution pour stabiliser les protéines membranaires dans la solution sans détergent.
Le système Peptidisc s’adapte spontanément à la taille, à la forme et à la typologie d’une myriade de protéines membranaires. Cela contraste avec d’autres mimétiques membranaires qui nécessitent souvent une optimisation fastidieuse. FhuA, une protéine de membrane externe d’E.coli, sera employée comme protéine cible modèle pour être reconstituée dans ce protocole.
Les vésicules de membrane externe seront isolées suivies de l’ajout de détergent pour solubiliser les protéines membranaires. Le peptide peptidisc est ajouté à la solubilisation et le détergent est dilué, formant spontanément des particules peptidisques. Ces particules solubles stabilisées sont maintenant utilisables pour de nombreuses applications en aval.
Ce protocole examinera l’interférométrie des couches biologiques comme application de la technologie Peptidisc. Ce protocole se concentrera sur la méthode de reconstitution PeptiQuick, une technique utile qui facilite la purification et la reconstitution simultanées des protéines membranaires. La méthode PeptiQuick de reconstitution des perles est effectuée dans une colonne de gravité Nickel-NTA IMAC standard prééquilibrée en détergent.
La membrane solubilisée est chargée sur la résine et les protéines non cibles sont emportées. Après que ce peptide est ajouté à la colonne et que le détergent est dilué rapidement. Le côté hydrophobe du peptide peptidisc s’associe aux régions hydrophobes exposées.
Le côté hydrophile du peptide maintient la protéine soluble dans la solution. L’excès de peptide est emporté. Imidazole est ajouté pour élucider la fureur reconstituée.
L’échafaudage Peptidisc peut être fonctionnalisé pour étiqueter indirectement les protéines de mémoire et ainsi ouvrir la porte à un ensemble plus large d’analyses en aval. Ici, nous exploitons le peptide biotinylated pour l’attachement aux capteurs enduits de streptavidine pour l’analyse BLI. L’interférométrie de biocouposition est une technique puissante sans étiquette pour étudier les interactions biomoléculaires dans la solution.
En plus de simplement démontrer les interactions, cette technique donne une lecture cinétique en temps réel et permet le calcul d’une constante de dissociation contraignante. Grâce à ce protocole, nous éliminons le besoin de détergent lors de l’analyse BLI, car cela peut modifier l’activité. L’interférométrie biocouche analyse le passage de la lumière blanche réfléchie par le capteur, ou la pointe, et les molécules macro liées au cours d’une interaction.
Pour mesurer les interactions, la pointe de sens est passée entre les solutions et le signal enregistré à chaque étape. Chaque pointe donne alors sa propre trace sur un sensogramme. Tout d’abord, une ligne de base de tampon seulement est établie.
Deuxièmement, le ligand est lié. Dans ce cas, FhuA et Peptidiscs biotinylated lie une pointe encoated de streptavidin. Ensuite, la pointe est lavée dans le tampon pour éliminer tout FhuA non lié.
Maintenant, la pointe est déplacée dans une solution avec une concentration connue d’analyte, ici ColM. Si une interaction se produit, cela donnera une courbe contraignante. Enfin, la pointe est déplacée dans le tampon et la dissociation mesurée.
Les taux observés d’association et de dissociation à chaque concentration de colonne peuvent être utilisés pour calculer la constante de dissociation. Hexahistidine marqué FhuA est exprimé dans la souche E-coli AW740 pendant 18 heures dans les médias amine. Les bactéries sont récoltées par centrifugation à 5000 G 10 minutes à quatre degrés Celsius.
La pastille cellulaire qui en résulte est re-suspendue dans le tampon TSG, puis dounced pour briser les touffes cellulaires et assurer une lyse approfondie. TMSF est ajouté aux cellules re-suspendues à une concentration finale d’un millimolaire juste avant la lyse. La lyse cellulaire est réalisée par trois passages par un microfluidise à 15 000 PSI ou une français presse à 8000 PSI.
Les cellules lysées sont collectées et une centrifugation à basse vitesse à 5000 G pendant 10 minutes à quatre degrés est effectuée. Un supernatant de la rotation à basse vitesse est chargé dans un rotor d’ultracentrifugeuse TI70 et centrifugé à 200 000 G pendant 40 minutes à quatre degrés pour granuler la membrane E.coli brute. Après l’ultracentrifugation, le supernatant est jeté et la pastille de membrane brute est re-suspendue dans une quantité minimale de tampon TSG.
Une membrane brute est dounced pour assurer son homogénéité. Un essai de Bradford est effectué pour vérifier la concentration en protéines de la membrane brute re-suspendue. Le tampon TSG est utilisé pour diluer la membrane brute à environ trois milligrammes par millilitre avant la solubilisation.
Triton X-100 est ajouté à la membrane brute re-suspendue à une concentration finale de 1% pour solubiliser sélectivement la membrane interne bactérienne. La solubilisation est effectuée pendant une heure à quatre degrés, avec un basculement doux. La membrane externe non solubilisée est isolée par ultracentrifugation à 200 000 G pendant 40 minutes, à quatre degrés.
Le supernatant qui en résulte contenant la membrane intérieure solubilisée est jeté. Tandis que la pastille, contenant la membrane extérieure, est re-suspendue comme avant dans TSG. LDAO est ajouté à une concentration finale de 1% à la membrane externe re-suspendue, et solubilisé pendant une heure à quatre degrés.
Enfin, une ultracentrifugation est effectuée, comme avant, pour pelleter des matériaux insolubles. Le supernatant qui en résulte contient une membrane externe solubilisée, y compris notre cible, sa FhuA taguée, maintenant prête pour la purification simultanée de l’IMAC et la reconstitution peptidisc. Une colonne de gravité Nickel-NTA IMAC est pré-équilibrée avec deux volumes de colonne de tampon de lavage IMAC.
L’imidazole est ajouté à une concentration finale de cinq millimolaires à la membrane externe solubilisée, diluée à 0,04%LDAO. La membrane extérieure solubilisée est chargée sur la résine Nickel-NTA, et le flux à travers recueillies. Ce flux à travers est rechargé sur la résine pour augmenter la liaison de résine de FhuA.
Après chargement, la résine est lavée avec 250 millilitres de tampon de lavage IMAC et les 50 premiers millilitres collectés. Après le lavage, le tampon de lavage est drainé juste au-dessus de la hauteur du lit en résine et le robinet d’arrêt de colonne fermé. Un millilitre de concentré, 10 milligrammes par millilitre, peptide peptidisc est ajouté à la colonne.
Après l’ajout de peptide concentré, 50 millilitres de diluer, un milligramme par millilitre, peptide peptidisc dans TSG est ajouté. La résine est agitée pour suspendre à nouveau les perles en TSG, en dessous du CMC de LDAO, formant ainsi des particules peptidisques. Après le piégeage peptidisc, la résine est autorisée à se déposer et la solution peptiide d’un milligramme par millilitre est drainée à travers la résine.
La résine est lavée avec 50 millilitres TSG pour enlever l’excès de peptide peptidisc. Enfin, les particules peptidisques sont diluées avec 50 millilitres d’imidazole de 600 millimlaires dans TSG. Une fraction millilitres sont collectées et 10 microlitres de 0,5 molaire EDTA sont ajoutés, un ions nickel lixivié léger clé.
Les fractions de départ, d’écoulement, de lavage et d’échappement sont chargées sur un gel SDS à 12 % et électrophorezed pendant 30 minutes à 60 milliamps. Le gel est taché et visualisé sur un scanner de gel. Le gel qui en résulte montre l’épuisement de FhuA dans le flux à travers, et l’enrichissement dans l’élitution.
Des bandes de contaminants mineures sont également observées dans les fractions échappées. Les fractions trois à sept sont sélectionnées pour la chromatographie d’exclusion de taille pour confirmer la solubilité peptidisc de FhuA et épuiser les contaminants. Un concentrateur centrifuge coupé de 30 Kilodome est utilisé pour concentrer les fractions de trois à sept.
Un millilitre des fractions d’elusion IMAC mis en commun est injecté sur la colonne S200 à un débit de 0,25 millilitres par minute dans le tampon TSG. Une fraction millilitres sont collectées et un gel SDS de 12% des fractions est exécuté. Les fractions pertinentes sont mis en commun et peuvent maintenant être utilisées dans les applications en aval.
BLI a été réalisé dans un ForteBio Octet RED96. Cet instrument déplace les broches BLI sur une plaque de puits 96 qui est d’abord mis en place à la main. Tous les puits sont remplis jusqu’à un volume final de 200 microlitres.
La colonne 1 est chargée de tampon cinétique pour permettre aux pointes d’équilibrer et de former un signal de base. La colonne deux est chargée d’une concentration prédéterminée du tampon ligand et cinétique. Dans ce cas, FhuA est le ligand, et est ajouté à la concentration de 2,5 microgrammes par millilitre.
La pointe de la ligne E sera utilisée comme référence, et est chargée avec tampon seulement. La colonne trois est chargée de tampon cinétique pour laver l’excès de FhuA de la pointe. Deux dilutions en série de l’analyte, dans ce cas ColM, est chargé de haut en bas dans la colonne quatre.
La plus élevée de ces concentrations est utilisée pour la ligne de référence, pour mesurer la liaison non spécifique de l’analyte à la pointe. La colonne cinq est chargée de tampon. Ici, le ColM se dissocie, et la dissociation mesurée.
Une fois la plaque préparée, le plateau à bout de capteur et la plaque préparée sont chargés dans l’instrument BLI. Le logiciel d’acquisition de données BLI est ouvert et une nouvelle expérience cinétique est lancée. L’onglet Définition de plaque est utilisé pour saisir la disposition de la plaque de 96 puits dans le logiciel.
Ici, le ligand FhuA est entrée comme la charge tandis que l’analyte ColM est entrée comme l’échantillon. L’onglet Définition d’analyse est utilisé pour définir la durée et la vitesse de rotation des plaques pour chaque étape de l’expérience. Ici, nous incluons une étape de base de 60 secondes, suivie d’une étape de chargement de 250 secondes, une deuxième étape de base de 300 secondes, une étape d’association analyte de 450 secondes, et enfin une étape de dissociation de 900 secondes.
Ces étapes sont attribuées individuellement à chaque colonne de la plaque de 96 puits en sélectionnant l’étape désirée et en cliquant à droite sur l’analyse Ajouter sur chaque colonne. L’onglet d’affectation du capteur est utilisé pour s’assurer que l’instrument Octet prend des broches BLI à partir de leur emplacement correct dans le plateau du capteur. L’onglet Expérience d’examen fournit un aperçu final de l’expérience, avant l’exécution.
BLI sera désormais réalisé par l’Octet RED. Ceci produira un sensogramme brut de données pour l’analyse. L’analyse est effectuée en ouvrant d’abord le logiciel d’analyse des biodonnées Octet.
L’onglet Sélection des données est utilisé pour localiser l’expérience et vérifier le résumé expérimental. Les concentrations de l’analyte ColM sont entrées ici. Ensuite, l’onglet Traitement est utilisé pour soustraire le signal de référence des données expérimentales.
La ligne de base est définie pour aligner l’axe Y comme si son taux de dés alliage était appliqué. Enfin, les données de processus sont sélectionnées. Les données sont isolées pour cette expérience, et Fit Curves est sélectionné.
Un raccord partiel de courbe d’association et de dissociation est choisi. Le Kd est calculé à partir de ce raccord. Le chromatogramme d’exclusion de taille est utilisé pour valider la reconstitution de l’ambute.
Le chromatogramme montre un pic symétrique unique, suggérant une préparation de protéine monodisperse. Le pic s’allonge de plusieurs millilitres après le volume du vide, indiquant des particules peptidisques solubles non agrégées. Les agrégats protéiques s’élit au volume vide, tandis que l’excès de détergents et de peptide s’élit après le pic principal.
L’augmentation du lavage des Peptidiscs formés alors qu’ils étaient encore attachés aux perles Nickel-NTA devrait épuiser ce dernier pic. Les agrégats protéiques sont souvent le résultat de l’exposition des protéines de mémoire à la solution sans détergent avant la reconstitution. Ce dernier chromatogramme d’exclusion est un diagnostic utile pour dépanner sa reconstitution.
Après le traitement des données expérimentales, une courbe est adaptée au sensogramme. L’exactitude de ce raccord est essentielle pour le calcul de la constante de dissociation. La parcelle de vue résiduelle décrit la différence entre les données expérimentales et le montage informatique.
Cela montre que pour les quatre concentrations de colonnes différentes, trois des courbes s’adaptent bien. Cependant, pour la plus forte concentration, la courbe ne produit pas un bon ajustement. Ceci suggère qu’à cette concentration plus élevée, il y a liaison hétérogène de colonne à la goupille.
Ce signal de concentration le plus élevé n’est donc pas inclus dans l’analyse cinétique selon les notes d’application ForteBio. Les trois autres courbes sont utilisées pour l’analyse cinétique. Une constante de dissociation entre FhuA et ColM, déterminée à l’aide de la méthode BLI et Peptidisc, est compatible avec des constantes déterminées par d’autres méthodes.
La calorimétrie isothermale et les nanodiscs, et la thermoforèse microscale et peptidisc ont donné des constantes de dissociation pas sensiblement différentes de notre valeur déterminée. Cette cohérence valide la méthode Peptidisc BLI pour mesurer la cinétique d’interaction. Très bien, donc, après avoir regardé cette vidéo, nous espérons que vous avez acquis une compréhension pratique de la force et la mise en garde des méthodes PeptiQuick.
Nous avons trouvé cette méthode particulièrement utile pour quantifier l’interaction FhuA ColM en l’absence totale de détergents. Et nous soupçonnons que le même flux de travail peut être appliqué pour caractériser toute autre interaction récepteur-ligand. Bonne chance avec vos expériences.
