Ce protocole fournit un cadre pour étudier l’incorporation d’acides gras exogènes provenant de sources hôtes complexes dans les membranes bactériennes, en particulier le staphylocoque aureus. Le protocole utilise une analyse lipidomique impartiale et des particules de lipoprotéine isolées des jaunes d’œufs de poulet comme source économique d’acides gras complexes pour quantifier l’incorporation d’acides gras dans les lipides bactériens. Les techniques de spectrométrie de masse décrit ici offrent une perspective inégalée du profil d’acide gras des lipides staphylococcus aureus, mais peuvent être adaptés pour étudier d’autres membranes bactériennes.
Lors de l’exécution de ce protocole, il faut prendre soin que chaque étape de fractionnement pour identifier et conserver la fraction contenant du LDL. L’élimination du sulfate d’ammoniac de la fraction plasmatique est essentielle pour les applications en aval des LDL. Fournir suffisamment d’espace dans le tube et changer l’eau au besoin pour permettre une dialyse efficace.
Pour commencer, lavez deux jaunes d’œufs deux fois avec 30 millilitres de saline tamponnée de phosphate stérile pour éliminer l’albumine résiduelle. Percer la membrane vitelline à l’aide d’une pointe stérile de pipette et égoutter le contenu de la membrane dans un tube stérile de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Ajouter environ 24 à 30 millilitres ou 17 solutions molaires de chlorure de sodium au pH sept au jaune d’œuf et mélanger vigoureusement.
Ensuite, placez le tube sur un shaker à bascule pour mélanger à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Centrifugeuse la dilution du jaune d’œuf à 10 degrés Celsius à 10 000 fois g pendant 45 minutes. Transférer la fraction plasmatique supernatante dans un tube conique stérile de 50 millilitres, laissant derrière elle la fraction granulaire granulaire granulée.
Et centrifugeuse à nouveau. Tout d’abord, mélanger la fraction plasmatique avec 40 volumes de masse pour cent de sulfate d’ammonium sur un shaker à bascule ou un dispositif similaire à quatre degrés Celsius pendant 60 minutes. Après avoir ajusté le pH, centrifugez la fraction plasmatique à quatre degrés Celsius et 10 000 g de temps pour une durée de 45 minutes.
Enlevez la fraction jaune semisolide supérieure en sept tubes de dialyse de taille pore kilodalton. Fournir un minimum de 25% d’espace supplémentaire dans le tube pour lui permettre de gonfler. Placez le tube de dialyse dans trois litres d’eau ultrapure pour dialyser pendant la nuit à trois degrés Celsius pour enlever le sulfate d’ammonium.
Après dialyse, centrifugeuse la solution à quatre degrés Celsius comme décrit précédemment. Retirer délicatement la fraction jaune supérieure semi-ssolide dans un tube stérile et la conserver à quatre degrés Celsius. Après l’incubation nocturne de la culture, transférer 500 microlitres dans deux flacons stériles déconcertés de 250 millilitres contenant 49,5 millilitres de bouillon tryptone de 1 %.
Incuber pendant environ quatre heures à 37 degrés Celsius avec des secousses pour atteindre la phase médiane. Transférer 100 millilitres de culture par incréments de 25 millilitres dans quatre tubes stériles de centrifugeuse de 50 millilitres et centrifuger les quatre tubes à 10 000 fois g pour pelleter les cellules. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau chaque granulé cellulaire dans 750 microlitres de bouillon tryptone de 1 %.
Combinez les quatre suspensions cellulaires de 750 microlitres en un seul tube de 15 millilitres. Et aliquot 350 microlitres de la suspension cellulaire en six tubes stériles centrifugeuse de 1,5 millilitre. Utilisez une pipette pour ajouter 30 microlitres de LDLs dans le tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre pour atteindre une concentration finale désirée de 5% et incuber à 37 degrés Celsius avec des secousses pendant quatre heures.
Centrifuger les cultures à 4 degrés Celsius à 16 000 fois g pour une durée de deux minutes. Et re-suspendre les granulés cellulaires dans 330 microlitres de stériles phosphate tamponné saline à laver. Répétez ce lavage une fois de plus.
Enregistrez le poids des six granulés de cellules humides en soustrayant le poids du tube vide. Casser congeler les granulés cellulaires sur la glace sèche. Ajoutez d’abord une boule de perles d’oxyde de zirconium de 5 millimètres sur chaque granule cellulaire.
Ajouter 740 microlitres de méthanol de qualité HPLC à moins 80 degrés Celsius directement dans chaque tube. Ajoutez ensuite deux microlitres de 50 dimyristoyl phosphatidylcholine micromolar comme norme interne. Placez l’échantillon contenant des tubes de centrifugeuse de 1,5 millilitre dans un port disponible sur un homogénéiseur de tissu de mélangeur de balles.
Homogénéiser les échantillons à basse vitesse. Réglage de deux à trois pendant trois minutes. Inspectez visuellement les échantillons pour détecter l’homogénéité.
Si des amas de cellules sont visibles, continuez l’homogénéisation dans le mélangeur de balles par incréments de deux minutes. Ajouter ensuite 270 microlitres de chloroforme à chaque échantillon dans un capot de fumée chimique. Vortex les échantillons vigoureusement pendant 30 minutes.
Centrifugez les échantillons dans une centrifugeuse sur banc jusqu’à 30 minutes au moins 2000 fois g. Dans le capot chimique des vapeurs, recueillir le supernatant monophasique et le transférer dans un nouveau tube à essai tout en évitant soigneusement la pastille protéique au fond du tube d’extraction. Transférez les extraits de lipides dilués préalablement préparés à un flacon d’autosampler approprié.
Pour l’analyse basée sur l’injection de flux, placez les flacons d’autosampler dans un autosampler à température contrôlée d’un système HPLC capable d’applications de flux capillaires. Configurer le système HPLC selon le manuscrit. L’élixent est introduit de la ligne de transfert HPLC au spectromètre de masse par une source d’ionisation électrospray équipée d’une aiguille métallique de calibre 34 à faible débit.
Dans le logiciel de commande d’instruments Thermo Tune Plus, réglez la tension d’ionisation à 4000 volts et le gaz de gaine à cinq. De même, réglez la température capillaire à 150 degrés Celsius et l’objectif S à 50%Cliquez sur le bouton d’analyse définir, et dans le menu analyseur, sélectionnez FTMS. Réglez le champ de plage de masse à la normale et dans le champ de résolution, sélectionnez 100 000.
Assurez-vous que le type d’analyse est réglé à plein. Sous le menu des plages de balayage, entrez 200 dans le premier champ de masse et entrez 2000 dans le dernier champ de masse. Après avoir défini davantage la précision de masse observée, faire la moyenne du signal à travers le large pic dans le chromatogramme ion total.
Cliquez à droite sur l’icône thumbtack dans la fenêtre de visualisation du spectre de masse et sélectionnez la liste du spectre de vue. À partir du même menu, sélectionnez les options d’affichage, puis tous les pics basculent la boîte dans le menu d’affichage. Cliquez sur le bouton correct pour fermer la fenêtre de visualisation.
Cliquez à droite sur l’icône thumbtack dans la fenêtre de visualisation du spectre de masse à nouveau et sélectionnez la masse exacte du presse-papiers d’exportation. Coller la cellule de données exportée A1 de la première feuille de travail dans la nouvelle feuille de calcul Excel et procéder selon le manuscrit. Pour effectuer des identifications lipidiques précises à base de masse, ouvrez le logiciel LIMSA.
À partir du menu principal, sélectionnez la liste de pointe sous le menu de type spectre. Sélectionnez le mode positif ou le mode négatif pour correspondre à la polarité dans laquelle les données de spectrométrie de masse ont été acquises. Dans la largeur maximale à moitié maximale et au-dessus de la fenêtre z, entrez dans la fenêtre de recherche de masse désirée pour trouver le pic.
Dans ce protocole, la teneur en LDL de la fraction plasmatique a été encore enrichie par la précipitation des lévitines bêta de 30 à 40 kilodaltons. La présence de bandes protéiques à 140, 80, 65, 60 et 15 kilodaltons est corrélée avec les apoprotéines des LDL. Le traitement par triclosan inhibe la croissance de l’aureus staphylocoque dans un milieu sans acides gras.
Tout en complétant des cultures avec le plasma de jaune d’oeuf comme sources exogènes d’acide gras surmonte l’inhibition de croissance triclosan-induite. De même, la supplémentation des cultures triclosan-traitées avec le jaune d’oeuf enrichi LDL restaure la croissance. En outre, l’ajout de LDLs jaune d’œuf soutient la croissance d’un acide gras S.aureus précédemment caractérisé, auxotroph.
La teneur en acides pré-gras a été mesurée dans le bouillon de tryptone de 1% ou le jaune d’oeuf de poulet LDL en employant l’injection de flux spectrométrie précise de masse de haute résolution. Des quantités minimales d’acide gras libre ont été trouvées. L’analyse orthogonale partielle la moins discriminante des phospholipides abondants de membrane d’aureus de staphylocoque a démontré la séparation claire de classe, avec une composition d’acide gras des conditions non traitées et de jaune d’oeuf de poulet LDL traitées.
L’enrichissement des LDL à partir du jaune d’œuf de poulet fournit une source peu coûteuse d’acides gras complexes pour étudier les interactions entre les pathogènes bactériens et les lipoprotéines hôtes. Le chloroforme et le méthanol utilisés dans la préparation des extraits lipidiques sont dangereux. S’il vous plaît assurez-vous d’utiliser ces reagents dans un capot de fumée chimique et de contenir tous les flux de déchets.
