Le protocole de reconstitution et de fusion détaillé ici est un moyen efficace d’étudier les protéines liées à la membrane dans une cale lipidique modèle et le mélange lipidique par des protéines de fusion. Ici nous décrivons une reconstitution détergent-aidée de l’atlastin recombinant de Drosophila, une protéine de fusion d’ER, dans les liposomes préformés de phosphatidylcholine. La fusion des protéoliposomes d’atlastine est alors mesurée par un essai de mélange lipidique fret-basé.
L’un des principaux avantages de la reconstitution assistée par détergent est que la protéine dans le détergent n’est pas exposée au séchage ou aux solvants. Nous montrons également ici que l’orientation de reconstitution de l’atlastine est très efficace. Un autre avantage de l’analyse de mélange de lipides à base de FRET est que les liposomes n’ont pas besoin d’être chargés avec n’importe quel colorant, et il n’y a pas besoin d’étapes supplémentaires de dialyse.
Pour commencer cette procédure, préparer les stocks de mélange lipidique en chloroforme, tel que décrit dans le protocole de texte. Ajouter un microcourard par millilitre de DPPC aux mélanges lipidiques, en s’assurant de réserver au moins huit microlitres de ce stock. Transférer la quantité désirée des mélanges lipidiques dans des tubes en verre à silex.
Ensuite, séchez les mélanges lipidiques sous un doux flux de gaz azoté pendant environ 10 minutes jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de chloroforme visible. Séchez le film lipidique résultant plus loin dans un dessiccator en aspirant pendant 30 minutes. Après cela, ajouter suffisamment d’A100 avec 10% glycérol, deux millimolaire 2-mercaptoéthanol, et un millimolaire EDTA au film lipidique pour ramener la concentration à 10 millimolar.
Resuspendez le film lipidique en tourbillonnant légèrement pendant 15 minutes à température ambiante. Congeler les lipides hydratés dans de l’azote liquide. Pour décongeler les liposomes, laissez reposer la solution à température ambiante pendant 30 secondes, puis transférez-les à l’eau pour une décongélation plus rapide.
Répétez ce cycle gel-dégel un total de 10 fois. Après cela, utilisez un mini-extrème pour passer les lipides à travers des filtres en polycarbonate, avec une taille de pore de 100 nanomètres, 19 fois. Pour déterminer la concentration totale de lipides des liposomes, ajouter quatre microlitres de bouillon lipidique et de lysosomes à trois millilitres de cocktail de scintillation.
Mesurez le nombre moyen par minute pour le stock et les liposomes, et calculez la concentration liposome, telle qu’décrite dans le protocole de texte. Conserver les liposomes à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Tout d’abord, mélanger la quantité appropriée de tampon, de détergent supplémentaire et de protéines dans un tube de 0,5 millilitre, tel que décrit dans le protocole de texte.
Ajouter rapidement les liposomes, et immédiatement vortex pendant cinq secondes pour homogénéiser le mélange. Incuber la réaction dans un nutator à quatre degrés Celsius pendant une heure. Pendant cette incubation, peser 0,2 gramme de perles adsorbents de polystyrène et les transférer dans un tube de microcentrifugeuse.
Ajouter un millilitre de méthanol au tube et mélanger pendant une minute pour dégazer les perles. Ensuite, aspirez le méthanol à l’aide d’une aiguille de calibre 21 ou plus. Pour commencer à laver les perles, ajoutez-y de l’eau.
Laisser les perles se mélanger avec l’eau pendant cinq minutes, puis aspirer l’eau. Répétez ce processus de lavage de l’eau quatre fois. Après cela, ajouter de l’eau pour amener le lisier de perles adsorbents en polystyrène à un volume d’un millilitre, avec une concentration finale de 0,2 grammes par millilitre.
Calculez la quantité de perles adsorbentes en polystyrène nécessaires pour adsorb tout le détergent de chaque échantillon, tel que décrit dans le protocole texte. Couper une pointe de pipette pour ramasser le lisier de perles. Transférez la quantité calculée de boue de perle dans un tube de 0,5 millilitre et aspirez l’eau.
Ajouter les échantillons au tube contenant les perles, et incuber dans un nutator à quatre degrés Celsius pendant une heure. Transférer les échantillons dans un tube frais contenant de nouvelles perles, en s’assurant de laisser les vieilles perles derrière. Incuber à nouveau en utilisant les mêmes conditions.
Répétez ce processus de transfert et d’incubation des perles deux fois. Après cela, transférez l’échantillon dans un nouveau tube contenant des perles fraîches et incubez en noix pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, retirez l’échantillon des perles et de la centrifugeuse à 16 000 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour granuler les agrégats de protéines insolubles.
Récupérez le supernatant, et déterminez la concentration finale de lipide par le comptage liquide de scintillation, tel que décrit dans le protocole de texte. Pour commencer, amener le donneur et l’accepteur protéoliposomes à une concentration de 0,15 millimlaire chacun dans A100 contenant du glycérol, du bêta-mercaptoéthanol, de l’EDTA et du chlorure de magnésium. Transférez chaque réaction à un puits dans une plaque plate de 96 puits adaptée à la lecture de fluorescence, en vous assurant de préparer au moins quatre réactions, y compris un triplicate et un contrôle négatif sans GTP.
Placez la plaque dans un lecteur de plaque préchauffé à 37 degrés Celsius. Mesurer la fluorescence NBD toutes les minutes pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez cinq millimolar GTP pour induire la fusion.
Mesurez la fluorescence NBD chaque minute pendant une heure en utilisant la même excitation et les mêmes émissions qu’auparavant. Après cela, ajouter cinq microlitres de 2,5%n-Dodecyl bêta-D-maltoside aux puits pour dissoudre les protéoliposomes, et mesurer la fluorescence maximale NBD chaque minute pendant 15 minutes en utilisant la même excitation et l’émission. Dans cette étude, l’atlastine recombinante de Drosophila est purifiée et reconstituée en liposomes préformés.
L’efficacité de la reconstitution de l’atlastine est déterminée par des protéoliposomes reconstitués flottants dans un gradient discontinu iohexol. Des échantillons des couches de gradient supérieur, moyen et inférieur sont récoltés et analysés par la coloration SDS-PAGE et Coomassie. La quantification du gel par densitométrie montre une efficacité très élevée de reconstitution avec des pertes négligeables, avec 96% de la protéine totale trouvée comme protéoliposomes qui flottaient à la couche supérieure.
Moins de 1 % des protéines ne sont pas reconstituées et se trouvent dans la couche moyenne, et seulement 3 % ne sont pas reconstituées, agrégées et sédimentées jusqu’à la couche inférieure. L’orientation de l’atlastine après reconstitution est quantifiée par des analyses de clivage de thrombine. Les échantillons sont analysés avec SDS-PAGE et Coomassie colorant et quantifiés par densitométrie.
La plupart des protéines reconstituées sont fendues, avec seulement 7% étant protégés de la protéase. La cinétique et l’étendue de la fusion protéoliposome à médiation atlastine sont analysées par des analyses de mélange de lipides. Une incubation de cinq minutes est effectuée avant d’induire la fusion avec GTP au point zéro temps.
Après une heure, n-Dodecyl beta-D-maltoside a été ajouté pour solubiliser les protéoliposomes et obtenir la libération maximale de transfert de résonance fluorescente. Le maximum de fusion dans la course est considéré comme 11% de la fluorescence maximale. Les lipides sont dissous dans le chloroforme.
Lors de la préparation des mélanges lipidiques, assurez-vous de le faire rapidement, sur un capot chimique, et sur la glace pour éviter toute évaporation. Il est possible d’analyser les protéoliposomes d’atlastine par microscopie pour visualiser les effets d’une ancre membranaire sur la forme et la taille liposome. Cette méthode a été étendue pour étudier d’autres protéines ancrés dans la membrane et comment le comportement dans une bicouche lipidique modèle.
Ce protocole utilise des lipides titrés pour quantifier les mélanges lipidiques. Assurez-vous de prendre les précautions nécessaires lorsque vous travaillez avec des matières radioactives.
