La technique de traçage décrite dans ce protocole nous aide à étudier la morphogenèse neuronale et à casser la connectivité dans le système de neurones moteurs de Drosophila. Le colorant lipophile peut rapidement se propager à toutes les parties de la membrane cellulaire avec une densité extrêmement élevée. C’est pourquoi notre protocole se résout efficacement à trouver les structures d’un neurone étiqueté.
Si un terminal d’axone est accessible avec une micropipette d’injection, cette technique pourrait être appliquée à n’importe quel neurone dans les stades larvaires et adultes des mouches ou dans d’autres organismes. Si vous n’avez aucune expérience de disséquer ou d’utiliser un microinjecteur précis de l’opération sur le spécimen, peut être difficile. Comprendre l’anatomie de l’embryon, aidera avec des conseils à la portion appropriée des outils pour effectuer la dissection ou une dinjection.
Pour commencer, préparer et mettre en page tous les matériaux de collecte d’embryons. Préparer l’appareil de filtration en coupant un tube de 50 millilitres et en coupant un trou dans le bouchon. Ensuite, placez un filtre à mailles avec 100 pores micromètres entre le tube et le bouchon.
Préparer la micropipette d’injection de colorant et l’aiguille de dissection du même tube capillaire d’un diamètre intérieur de 1,2 millimètre. Tirez le tube avec une micropipette, puller à 7%de 170 volts sortie maximale pour créer une aiguille pointue avec un cône d’environ 0,4 centimètres de longueur. Pour préparer la micropipette d’injection de colorant, faire tremper le broyeur avec un agent mouillant et placer l’aiguille sur la pince de micropipette à 25 à 30 degrés.
Puis abaissez la pointe sur les deux tiers du rayon à partir du centre de la surface biseautante. Moudre l’aiguille pendant qu’une seringue avec tube pousse l’air dedans. Marquez la micropipette avec un marqueur permanent à pointe fine pour indiquer la position de l’ouverture à la pointe après le biseauté, car il peut être difficile de localiser l’ouverture étroite qui se forme à un angle.
Laissez les mouches pondre des œufs toute la nuit à température ambiante et recueillez le tuyau avec les œufs le matin. Pour recueillir les embryons, déchlorer les œufs dans l’assiette avec 50% d’eau de Javel pendant cinq minutes. Une fois les chlorions effacées, versez le contenu de la plaque à travers l’appareil de filtration ou la passoire cellulaire pour isoler les embryons.
Utilisez une bouteille d’eau de compression pour diluer l’eau de Javel laissée sur la plaque et recueillir autant d’embryons que possible en décantant le mélange dans le filtre. Laver les embryons trois à quatre fois avec de l’eau jusqu’à ce que l’odeur d’eau de Javel se dissipe. Retirez le filtre de l’appareil et lavez-le sur une autre assiette propre avec de l’eau.
Puis décanter l’eau de la nouvelle plaque que les embryons sont sur. Utilisez des forceps fins pour sélectionner cinq à dix embryons à 15 heures après la ponte et placez-les sur du ruban adhésif à double face avec le côté dorsal orienté vers le haut. Ajouter la solution saline de sonnerie d’insectes à la piscine de dissection pour protéger les embryons contre la dessiccation.
Utilisez une aiguille en verre sous un microscope à dissection pour faire glisser l’embryon hors de la membrane de middling de la bande sur le verre, en prenant soin de ne pas endommager les tissus intérieurs de l’embryon. Ensuite, couper à travers la ligne médiane d’un seul embryon à sa surface de son postérieur à l’extrémité antérieure. Retournez les tissus épithéliales du centre et fixez le bord épidermique sur la surface de la glissière de verre.
Utilisez une aiguille reliée par tube avec une ouverture de pointe d’environ 300 micromètres pour aspirer ou souffler de l’air pour enlever les troncs trachéaux longitudinals dorsal ainsi que les intestins restants. Utilisez 4%PFA et PBS pour fixer les embryons pendant cinq minutes à température ambiante sur un shaker orbital. Ensuite, lavez-les trois fois avec PBS.
Tacher les embryons avec un microlitre d’anticorps anti-raifort peroxidase conjugué avec le colorant Cyanine3 et 200 microlitres de PBS pendant une heure sur le shaker orbital. Et répétez les lavages dans PBS. Pour remplir la micropipette d’injection, placez-la dans le support capillaire.
Placez ensuite la glissade de teinture sur la scène et utilisez le micromanipulateur pour le positionner au-dessus de la glissière. Ajustez ensuite la scène pour placer la micropipette sur le colorant. Recueillir le colorant dans la micropipette en fixant la pression d’injection entre 200 et 500 hectopascal, le temps d’injection entre 0,1 et 0,5 secondes et la pression de compensation à zéro pendant cinq minutes.
Une fois que le colorant a été recueilli, retirez la toboggan de teinture et placez l’échantillon sur le stade du microscope. Ensuite, augmenter la pression de compensation à une gamme de 30 à 60 hectopascal et abaisser la micropipette dans l’échantillon. Utilisez la lentille 10 fois objective pour localiser l’embryon et aligner la micropipette avec l’embryon.
Changer l’objectif de lentille à une immersion d’eau 40 fois lentille. Et submerger la lentille dans le PBS. Utilisez la microscopie de fluorescence pour vérifier la morphologie neuronale marquée par l’anti-HRP Cy3 et déterminer le site d’injection.
Lorsque l’embryon est au point changer la position de la micropipette pour entrer en contact doux avec la pointe de l’axon d’intérêt. Ensuite, utilisez la microscopie de champ lumineux pendant l’injection pour voir la gouttelette de colorant. Déposez le colorant dans l’hémisegment abdominal droit à la jonction neuromusculaire de l’aCC ou du RP3 avec did ou dio.
Utilisez le contrôle de la main pour libérer le colorant et enlever la micropipette. Passez ensuite au site d’injection suivant. Incuber l’échantillon pendant une heure à température ambiante sur un shaker orbital avant l’imagerie.
À l’aide de forceps fins, retirer les bandes de la glissière de verre. Pour monter l’échantillon, préparer un glissement de couvercle avec une petite quantité de graisse sous vide aux quatre coins. Placez-le soigneusement sur l’échantillon, en vous assurant d’éviter les bulles d’air.
Poussez vers le bas le glissement de couverture pour ajuster l’espace de l’échantillon pour permettre la distance de travail entre l’objectif et la glissière. Retirez tout excès de PBS avec des lingettes de tâches. Sceller complètement les bords du bordereau de couverture avec du vernis à ongles.
Image à 10 fois et 100 fois grossissement avec un microscope confocal et traiter les images, avec le logiciel imageJ. Ce protocole a été employé pour rétrograder l’étiquette le muscle innervating de neurone de moteur d’aCC un et le neurone moteur RP3 innervating muscles six et sept. Les branches dendritiques des neurones moteurs ACC et RP3 présentent un chevauchement important.
Les deux neurones sont bipolaires, établissant deux populations différentes de dendrites. Pour démontrer les capacités quantitatives de cette méthode, le nombre total de pointes de dendrite a été compté dans le type sauvage et les mutants Dscam1. Les dendrites ipsilateral d’aCC sont montrés pour le type sauvage, mais peu de dendrites ipsilateral ont été observés pour le mutant de Dscam1.
Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de se rappeler que la taille de la gouttelette de teinture est cruciale, qui est d’environ 10 à 20 micromètres. Testez la taille sur le ruban à double face, puis appliquez-le sur le site d’injection. En utilisant cette procédure, nous pouvons profiter de la propriété commutable photo de la sonde DiD pour obtenir des images de super résolution de la membrane plasmatique.
De cette façon, nous pouvons étudier la caractérisation ultra structurelle des membranes synaptiques à la jonction neuromusculaire. On a fait le clic. Nous avons effectué l’analyse phénotypique des dendrites d’aCC dans la souche mutante, et découvrons qu’une injection de Dscam1-Dock-Pak définit le site de l’excroissance dendrite dans aCC.
