Cette méthode peut être facilement adaptée pour observer les signaux d’autres protéines fluorescentes ou peut être utilisée pour l’image des axones chez d’autres adultes Le principal avantage de cette technique facilite une excellente reconstruction tridimensionnelle et la visualisation des axones et de leurs tonnelles terminales. Commencez par remplir le nombre approprié de puits dans une plaque de verre multi-puits avec 70% d’éthanol. Utilisez une brosse pour ajouter de 15 à 20 mouches anesthésiées au dioxyde de carbone de tout âge ou sexe à chaque puits et tamponnez doucement les mouches dans l’éthanol jusqu’à ce qu’elles soient complètement submergées.
Après pas plus d’une minute, rincer les mouches trois fois avec une solution de détergent surfactant non ionique de 0,3 % dans une solution saline tamponnée de phosphate pendant au moins 10 minutes par lavage. Après le dernier lavage, utilisez des forceps pour enlever la tête et l’abdomen de chaque mouche sans endommager le segment thoracique ou les jambes et utilisez la pointe d’une paire de forceps fins pour appliquer doucement mais fermement la pression sur la jonction coxa-thorax pour détacher une jambe du segment thoracique. Placez les pattes dans un puits d’une nouvelle plaque multi-puits contenant du paraformaldéhyde fraîchement préparé à 4 % sur la glace pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius.
Il est important de pousser doucement les jambes dans le tampon de fixation sans les laisser flotter pour obtenir des jambes bien fixées. Le lendemain, lavez les jambes cinq fois dans une solution de détergent surfactant frais de 0,3 % non ionique pendant 20 minutes par lavage. Après le dernier lavage, remplacer le détergent par un milieu de montage et garder les jambes dans le milieu de montage pendant au moins 24 heures.
Le lendemain, ajouter environ 20 microlitres de 70% glycérol à côté de l’extrémité enduite de la lame de microscope en verre et couvrir le glycérol avec un coverslip de 22 par 22 millimètres. Ensuite, ajoutez une ligne d’environ 10 microlitres de milieu de montage à droite du coverslip et appliquez une deuxième ligne de 30 microlitres de milieu de montage à droite de la ligne de 10 microlitres. À l’aide de forceps fins, transférer une jambe de la plaque multi-puits dans une goutte de milieu à la bande de 10 microlitres de milieu de montage dans un côté externe vers le haut ou vers le bas orientation.
Répétez jusqu’à ce que six à huit jambes aient été montées et alignées et placez un deuxième coverslip sur les jambes de sorte que le deuxième coverslip repose légèrement sur le premier coverslip. Ensuite, utilisez du vernis à ongles à chaque coin des coverslips pour les fixer en place. Pour l’image des jambes, utilisez le laser de 488 nanomètres et deux détecteurs simultanément pour mettre en place la première piste pour obtenir à la fois le GFP et cuticule auto fluorescence.
Sélectionnez un objectif d’immersion d’huile de 20 à 25 X et réglez la résolution à 1024 pixels d’ici 1024 avec une profondeur de 12 bits et réglez l’espacement z à un micromètre. Chargez la diapositive sur l’étape du microscope et en utilisant la même puissance laser pour les deux détecteurs, ajustez le gain du premier détecteur pour obtenir un signal GFP lumineux et ajustez le deuxième détecteur pour s’assurer que certaines zones avec un signal cuticule élevé produisent un signal saturé dans ce détecteur. Ensuite, imagez les jambes à l’aide de la tuile ou des options de position pour capturer toute la jambe si une jambe est étendue ou trop grande pour être photographiée dans un seul cadre.
Pour le traitement d’image, ouvrez la pile confoccale dans ImageJ Fiji et utilisez le plugin Bio-Formats pour ouvrir toutes les images qui ne sont pas au format TIFF. Pour diviser les canaux, sélectionnez l’image, la couleur et les canaux fractionnement. Pour soustraire le signal cuticule du signal GFP, ouvrez process et calculateur d’image et sélectionnez la pile du détecteur un comme image un.
Dans la fenêtre de fonctionnement, sélectionnez soustraire et sélectionnez la piste du détecteur deux comme image deux de sorte que seul le signal GFP endogène sera obtenu. Utilisez l’image, les piles, Z Protect pour générer une projection d’intensité maximale pour le signal GFP endogène. Utilisez les commandes de la fenêtre de contrôle de luminosité pour ajuster la luminosité et le contraste.
Ensuite, générer une intensité moyenne pour la cuticule, suivie par l’image, la couleur et les canaux de fusion pour fusionner la pile GFP de retour avec la pile cuticule seulement acquis à partir du détecteur deux. Il en résultera une image RGB composée du signal GFP spécifique aux tissus ainsi que le signal cuticule pour aider à identifier les tonnelles d’axon dans les segments des jambes. Pour utiliser la macro, ouvrez la pile confoccale et cliquez sur Image, Ajustez et Luminosité/Contraste.
Cliquez ensuite sur Plugin et Macro Run pour exécuter la macro et suivre les instructions. Lorsqu’on lui demande de spécifier l’opération dans la fenêtre du calculateur d’image, sélectionnez l’image une comme pile 1. Dans la fenêtre d’opération, sélectionnez soustraire.
Sélectionnez l’image deux comme pile deux. Lorsqu’on leur demande d’ajuster le contraste, utilisez les commandes de la fenêtre de contrôle de luminosité pour ajuster le contraste de luminosité de l’image de projection maximale de GFP et de la projection moyenne de la cuticule pour générer une image fusionnée RGB des deux signaux montrant le GFP en vert et la cuticule en gris. Fusionnez ensuite les résultats de la pile un et de la pile deux pour générer une pile combinée de GFP et de cuticules qui peut être utilisée à l’étape suivante.
Pour visualiser les jambes en trois dimensions, ouvrez la pile RVB dans un logiciel 3D approprié. Dans la fenêtre de dialogue popup, sélectionnez tous les canaux de la section de conversion de mode et entrez la taille d’un voxel obtenu à partir de l’analyse précédente. Dans le canal un module, cliquez à droite et sélectionnez Afficher et Volren.
Puis cliquez à gauche sur le module Volren. Dans la section Propriétés, cliquez à gauche sur Advanced et sélectionnez DDR. Ajustez ensuite la valeur gamma pour voir l’arrière-plan cuticule.
Dans le canal deux module, cliquez à droite et sélectionnez Display Volren. Puis cliquez à gauche sur le module Volren, Modifier et sélectionner volrenGreen.col. En utilisant cette procédure, le signal de la cuticule peut être combiné avec le signal GFP pour identifier le positionnement des axones dans les jambes.
Il est d’une importance cruciale d’obtenir des jambes bien fixées. Dans les jambes correctement fixées, les structures internes dans les jambes sont d’une couleur uniforme et les trachées, qui sont sombres, sont visibles. Dans les jambes mal fixées, le matériel foncé est présent dans le tarse et le tibia et le système trachéal n’est pas clairement visible dans le fémur et la coxa.
La procédure que nous avons décrite ici surmonte le défi de détecter l’expression fluorescente dans les axones de neurone moteur par une cuticule fluorescente épaisse et automatique avec la haute résolution. Ainsi, le signal fluorescent propre et détaillé obtenu nous permet de visualiser et de quantifier la caractéristique tridimensionnelle des tonnelles d’axon à l’aide de programmes d’imagerie 3D. Ainsi, cette technique nous permettra d’utiliser la drosophile adulte comme modèle non seulement pour étudier le développement du neurone moteur, mais aussi pour étudier, pour comprendre l’impact de maladies dégénératives telles que eras sur le système locomoteur intégré.
