Cette vidéo fournira une description détaillée, comment effectuer un membre orthotopique arrière droit, rat transplanté au milieu de la cuisse. Le membre postérieur droit du rat donneur est amputé au niveau du milieu de la cuisse, puis stocké sur de la glace. Le membre postérieur droit du rat receveur est également amputé au niveau du milieu de la cuisse.
Le membre du rat donneur est ensuite fixé au rat receveur. Nous allons décrire comment rattacher l’os, l’artère, la veine, les nerfs, les muscles et les systèmes cutanés. La greffe de membre, plus spécifiquement, l’allotransplant composite vascularisé, VCA, a la promesse thérapeutique large.
Mais il est actuellement limité par les techniques, l’immunosuppression, et la récupération neuromotrice fonctionnelle pauvre. Notre modèle met l’accent sur des techniques microchirurgical méticuleuses éprouvées par le temps, telles que l’anastomose vasculaire cousue à la main et la coaptation neurale. Nous avons effectué plus de 200 de ces chirurgies en plus d’un an.
Bien qu’il y ait une courbe d’apprentissage initiale au microchirurgien de début, en utilisant cette vidéo pour apprendre notre méthode et leur engagement à la pratique dédiée, n’importe quel microchirurgien sera en mesure de maîtriser ce modèle. Toutes les expériences ont été menées conformément au guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health, NIH, et ont été approuvées par le Northwestern University Animal Care and Use Committee. Les procédures spécifiques ont été effectuées sur un protocole IS 00001663.
Choisissez un rat âgé de 8 à 16 semaines pesant entre 250 et 400 grammes au moment de la chirurgie. Induire une anesthésie générale avec 5% d’isoflurane à travers un vaporisateur avant de couper la fourrure du rat membre postérieur. À l’aide d’un cône avant pour maintenir l’anesthésie entre 2 et 2,5 %, placez le rat sur la planche d’opération avec un radiateur en dessous.
Désinfectez la peau glaçante avec 70% d’alcool à friction et protégez le champ chirurgical avec de la gaze stérile. À l’aide d’un microscope microchirurgical approprié et des instruments microchirurgaux présentés ici, ainsi que d’une électroctérité bipolaire et monopolisaire facile d’accès, vous serez prêt à commencer la dissection. Utilisez un ciseaux pour faire une incision circonférentielle et cutanée autour du membre arrière droit.
Commencez dans le pli inguinal immédiatement au même niveau que le ligament inguinal et prolongez dorsalement latéralement pour compléter l’incision circonférentielle. Et puis exposer la couche musculaire directement sous l’incision, disséquer et cautériser les vaisseaux épigastriques superficiels, qui mènent de la couche musculaire à l’aileron proximal de la peau vient de créer. Refléter le rabat proximal superomedially au ligament inguinal et le volet distal de peau inferolaterally au genou.
Utilisez un rétracteur de fil ou une gaze roulée pour aider à exposer le champ. Observé que l’anatomie inguinale du rat est semblable à l’homme; de latéral à médial se trouvent le nerf, l’artère, et la veine. Disséquer le nerf fémoral, le diviser fortement au ligament inguinal proximal à la bifurcation, si possible.
Rétractez le nerf divisé de façon inférieure, en le gardant en sécurité hors de la route, couvert sous la gaze humide. En attirant l’attention sur l’artère fémorale et la veine utiliser quatre centimètres de long 7-0 liens de soie pour rétracter atraumatically les navires au lieu de les manipuler directement. Prêter une attention particulière maintenant permettra d’améliorer votre résultat anastomotic final.
Ligate toutes les branches des vaisseaux fémoraux avec des attaches de soie 7-0. Répartir les branches entre les liens. Les branches artérielles et veineux qui nécessitent la division incluent l’iliaque circonflexe superficiel et les vaisseaux musculaires.
Le circonflexe superficiel iliaque est généralement plus grand et semble plonger profondément comme le ferait le fémoral profunda chez l’homme, mais la profunda est absente chez le rat. Les branches plus distales des vaisseaux fémoraux, telles que le plus haut géniculaire et la branche saphenous n’exigent habituellement pas la division. Maintenant ligate l’artère fémorale avec des liens de soie 7-0 aussi proximal au ligament inguinal que possible et diviser entre les liens.
Semblable à l’artère, ligate et diviser la veine fémorale. Réfléchissez à la fois l’artère et la veine de façon inférieure, en toute sécurité à l’extérieur, recouverte sous la gaze humide ainsi que le nerf fémoral couvert précédemment. Disséquer les groupes musculaires ventraux, en prenant soin de cautériser tout vaisseau visible qui se pose.
Attention à l’hémostase maintenant permettra de minimiser la perte de sang receveur lors de la reprofusion plus tard. Profondément aux groupes musculaires ventraux, identifier et diviser brusquement le nerf sciatique proximal à ses branches. Les trois branches sciatiques sont généralement visibles, tibiales, périonales et surales.
Tous les trois doivent être conservés dans le membre donneur. Une quatrième branche cutanée n’est généralement pas observée dans cette dissection. Finissez de diviser les groupes musculaires ventrals et dorsal restants au niveau du milieu de la cuisse avec une hémostase méticuleuse.
Il peut être nécessaire de rétracter le membre avec méditation pour compléter la division des muscles. Transect l’os du fémur au milieu de l’arbre à l’aide d’une scie rotative sans fil portative. Le membre est maintenant libre du donneur.
Après avoir enlevé la greffe de membre du donneur, couper les extrémités attachées en soie de l’artère fémorale côté greffe et souches veineuses, ouvrant ainsi les vaisseaux. Insérez un angiocathéter de calibre 24 dans la souche de l’artère greffière et rincez la greffe avec 250 unités internationales d’héparine diluées en 5 millilitres de solution saline normale glacée, en prenant soin de la regarder sortir de la veine ouverte. Rincer doucement la greffe pendant environ trois minutes.
Un rinçage excessif et énergique peut endommager l’endothélium. Placer la greffe dans un plat salin réfrigéré niché dans un seau à glace jusqu’à la transplantation. Euthanasier le rat donneur avec thoracotomie bilatérale.
La chirurgie du receveur commence semblable à la chirurgie du donneur, anesthésier le rat, couper la fourrure, faire une incision circonférentielle dans le pli inguinal, reflétant les volets de la peau, disséquant le nerf fémoral, l’artère et la veine. Et ligating les mêmes navires de branche comme décrit précédemment. Cependant, pendant cette opération, divisez le nerf fémoral plus distally que pour le donateur, mais proximalement à la bifurcation si possible.
Divisez et libérez l’artère et la veine fémorales et serrez-les de façon immédiate respectivement au niveau du ligament inguinal avec des pinces microchirurgicales de bouledogue. Continuer la chirurgie comme décrit précédemment, en divisant les muscles ventral approuvant de la cuisse au niveau du milieu de la cuisse avec une hémostase méticuleuse, tout en rétractant le membre médiocrement si nécessaire. Identifier et diviser le nerf sciatique proximal jusqu’au point de branche et transecter le fémur au milieu de l’arbre à l’aide de la scie rotative.
Retirez le membre arrière droit natif du receveur et disposez-le de façon appropriée conformément aux lignes directrices locales du Comité de soins et d’utilisation des animaux. Il est très important à ce stade de baisser l’isoflurane à un à 1,5% par le cône avant. Trop d’anesthésie au cours de cette partie moins douloureuse de la procédure conduira à la mort du rat.
Il est temps de coaptiser les os ensemble. À l’aide de la scie rotative portative, raser toute irrégularité du donneur et du receveur des extrémités coupées du fémur. Coupez l’extrémité du moyeu d’une aiguille de calibre 18, qui deviendra la tige intramédullaire du fémur.
Avant de manipuler l’os, appliquez une petite quantité d’une cire osseuse sur l’extrémité coupée du fémur pour réduire les saignements de moelle pendant le processus de reaming. Coapt les os fémoraux donneurs et receveurs à l’aide de l’aiguille de calibre 18 comme tige intramédullaire. Une certaine force est nécessaire, mais ne ream ni l’os jusqu’à fracturer le cortex.
Au besoin, retirez l’aiguille et coupez-la à une longueur inappropriée de sorte que les deux os s’adaptent en douceur sur l’aiguille sans aiguille montrant entre l’os. Placez un petit support tel qu’un tampon de gaze ou une petite roche ou de l’argile de modélisation sous le membre donneur pour le garder hors tension. Reapproximate les groupes musculaires ventraux avec huit à 10 sutures simples interrompues de polyglactine 5-0 de sorte que la greffe ne tourne pas autour de l’aiguille du fémur.
Cela donne à la branche la stabilité des anastomoses. Maintenant, commencez les anastomoses. Irriguer périodiquement la greffe et le champ chirurgical avec la solution saline glacée pour une meilleure visualisation et pour réduire des dommages ischémiques de reperfusion.
Alignez les artères fémorales et l’anastomose du donneur et du receveur de bout en bout à l’aide d’une simple suture en nylon interrompue de 10 à 0, en évitant à la fois la tension et le looping. L’artère nécessite en moyenne six sutures. Semblable à l’artère, anastomose les veines fémorales de donateur et de destinataire de bout en bout.
La veine nécessite de six à huit sutures. L’irrigation saline froide généreuse, la technique atraumatique de manipulation de navire, et laisser de longues queues pour servir de sutures de séjour pour la rétractation de navire sont des outils importants pour les anastomoses microchirurgical efficaces. Placez une quantité modérée de poudre hémostatique de cellulose sur les deux anastomoses, et retirez par la suite les pinces microchirurgical proximales de bouledogue sur la veine et l’artère.
Inspecter les deux anastomoses pour une bonne patency et le flux. Utilisez des bâtonnets d’écouvillon de coton pour propulser doucement la veine et inspecter la bonne hémostase sur les deux anastomoses. Lorsque les deux anastomoses sont confirmées satisfaisantes, coupez les queues de suture de long séjour restantes pour correspondre aux autres.
Repositionnant le rat à la position latérale gauche de decubitus, emploiez l’électrocautery libéral pour atteindre l’hémostase méticuleuse de n’importe quel saignement de muscle de reperfusion. L’attention est tournée vers les anastomoses nerveuses une fois l’hémostase musculaire assurée. Reapproximate les groupes musculaires dorsal qui se trouvent directement sous le nerf sciatique avec des sutures de polyglactine simples interrompues 5-0.
Coupez toutes les extrémités coupées par les nerfs qui semblent en lambeaux. Reapproximate le nerf sciatique avec des sutures de nylon 10-0 s’efforçant de morsures épinéurales. Huit à dix sutures simples interrompues suffiront habituellement.
Reapproximate les groupes musculaires dorsal restants avec des sutures de polyglactine 5-0. Ensuite, fermez la peau dorsale avec 4-0 polyglactine suture continue en cours d’exécution. Repositionner le rat à la position supinée, ré reapproximate le nerf fémoral avec suture en nylon 10-0, encore une fois, la lutte pour les morsures épinéurales.
Deux à trois sutures simples interrompues suffiront habituellement. Fermez le reste de la peau ventrale de la même manière que la peau dorsale. Évitez l’excès de queue de suture, qui peut être irritant pour le rat une fois éveillé.
Une fois que les animaux sont sortis de la fenêtre postopératoire immédiate, ils peuvent être testés pour la récupération neuromotrice. Le test Hargreaves est utilisé pour tester la sensation thermique. Placez le rat dans le récipient d’essai et lui a permis de s’acclimater pendant 20 minutes.
Le verre de l’appareil est confirmé propre, et la source de chaleur est confirmée pour travailler avec le doigt de l’enquêteur. Avant de tester, confirmez que le rat est éveillé et que la patte testée est positionnée au-dessus du détecteur de mouvement infrarouge. Transmettre l’énergie thermique au niveau d’intensité 90.
Le retard dans le déplacement de la patte par l’animal loin de la source de chaleur est enregistré. Si aucun mouvement ne se produit dans les 20 secondes, le test est interrompu pour prévenir les blessures. Obtenez cinq essais par membre testé, à l’exclusion de la valeur la plus élevée et la plus basse avant de calculer le temps moyen de latence de retrait pour chaque animal.
Voici la conception opérationnelle représentée dans le format de dessin animé. Le membre postérieur droit des rats donneurs et receveurs est amputé au niveau du milieu de la cuisse sous forme de coupe transversale sciatique. L’artère fémorale, la veine, et le nerf, aussi bien que le nerf sciatique et l’os de fémur doivent alors être reconnectés dans la chirurgie de destinataire.
Le modèle peut être utilisé pour montrer les effets différentiels de survie de la suppression immunitaire et de la stratégie de transplantation. Avec cette technique, la survie à long terme est réalisable. Le modèle peut être employé pour étudier la récupération sensorielle de nerf, qui peut être évidente par quatre semaines postopératoirement.
La fonction motrice peut également être interrogée à l’aide d’une plate-forme d’analyse de la démarche. Ici, nous avons présenté une plate-forme modèle de rat avec des caractéristiques de survie favorables, que nous utilisons pour sonder la récupération sensorielle et motrice comme on le voit dans les chiffres de la procédure. Greffe de membre dans la catégorie plus large de VCA, allotransplantation vasculaire de composant a la promesse thérapeutique largement applicable n’est pas encore remplie.
Les principaux obstacles sont les techniques actuelles d’immunosuppression et de récupération neuromotrice. Le développement de nouvelles techniques dépendra d’une modélisation animale flexible, robuste et reproductible. En utilisant cette plate-forme, nous espérons que les chercheurs seront en mesure de faire progresser de multiples facettes de la greffe des membres.
Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos prochaines étapes.
