Ce protocole peut être utilisé pour la biosynthèse des cercosporines par fermentation microbienne, qui à son tour peut être utilisée pour synthétiser les hétérocycles contenant de l’azote dans les conditions vertes et douces. Un avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée comme un pont entre les méthodes de fermentation microbienne et les processus synthétisés organiques. Les hétérocycles contenant de l’azote sont non seulement des squelettes importants pour de nombreux produits naturels avec des bioactivités, mais ils sont des précurseurs synthétiques pour de nombreux produits agrochimiques et médicaments.
Yan Zhang, technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure avec Philippe Icyishaka. Pour la préparation alpha-Halo-N-acyl-hydrazone, peser 10 millimlaires de cétone et 10 millimolaires d’hydrazine benzoyle dans un flacon. Ajouter 20 millilitres de méthanol au flacon et équiper le flacon d’une barre de remue-remuer et d’un bouchon en caoutchouc.
Injectez lentement 250 microlitres d’acide chlorhydrique dans le mélange et incubez le flacon dans l’air à température ambiante. Après une heure, recueillir le précipité après la réaction par filtration, et laver le produit avec de l’acétone. Ensuite, séchez le précipité par vide, et identifiez le produit par NMR.
Pour préparer la cercosporine, chargez un flacon de secousse de trois litres avec un litre de S-7 moyen, et inoculez la souche productrice de cercosporin dans le flacon de secousse. Culture du mélange dans des conditions légères à 135 révolutions par minute et 25 degrés Celsius pendant deux semaines. À la fin de l’incubation, utiliser une pompe à vide pour soumettre le bouillon de fermentation à la filtration sous vide, et extraire la pastille et le supernatant séparément avec trois volumes de 50 millilitres de dichloromethane.
Recueillir les granulés pour les sécher dans un séchoir à congélateur et combiner les phases organiques. Laver les phases organiques avec de l’eau deux à trois fois et concentrer la solution sous vide. Redissolvez les résidus avec du méthanol analytique et filtrez le produit à travers une membrane de microfiltration organique de 18 micromètres.
Puis purifier la cercosporine avec une colonne Sephadex LH-20, et d’identifier le produit par HPLC selon les protocoles standard. Pour préparer 1, 2, 3-thiadiazole, ajouter tout le volume de l’alpha-Halo-N-acyl-hydrazone, un milligramme de cercosporine, 27 milligrammes de tert-butoxyde de potassium, et 39 milligrammes de thiocyanate de potassium dans un tube Schlenk de 10 millimètres équipé d’un bouchon en caoutchouc et d’une barre d’agitation. Purger le tube schlenk avec de l’oxygène trois fois avant d’injecter deux millilitres d’acétylonitrile sec dans le tube.
Soumettons le tube à une LED bleue de cinq watts par le bas pendant 16 heures avant de le laver quatre fois avec 15 millilitres de solution de chlorure de sodium saturé. Après le dernier lavage, mélanger la phase aqueuse et ré-extraire la phase aqueuse avec quatre volumes de 15 millilitres d’acétate d’éthyle. Mélanger la phase organique et sécher avec du sulfate de sodium anhydre.
Retirer le solvant à l’évaporateur sous vide. Pour purifier le produit avec une chromatographie à couche mince, tracez une ligne droite sur la plaque de silice et ajoutez le produit dissous à la ligne. Mettez la plaque de silice dans le cylindre de chromatographie avec 10 à un PE à EA. Après, dissoudre la silice dans DCM.
Retirer la silice du produit par filtration et sécher le DCM à l’aide d’un évaporateur rotatif. Identifiez ensuite le composé par NMR selon le protocole standard. Pour préparer 1, 4, 5, 6-tetrahydropyridazine, ajouter tout le volume de l’alpha-Halo-N-acyl-hydrazone, 2,7 milligrammes de cercosporine, et 195 milligrammes de carbonate de césium dans un tube Schlenk de 10 millilitres équipé d’un bouchon en caoutchouc et d’une barre d’agitation.
Purger le tube schlenk trois fois avec de l’azote et injecter deux millilitres d’acétylonitrile dans l’eau dans le tube. Soumettons le tube Schlenk à une LED bleue de cinq watts par le bas pendant 16 heures suivie de quatre lavages avec 15 millilitres de chlorure de sodium saturé par lavage. Combinez la phase aqueuse et ré-extrayez la phase aqueuse avec quatre volumes de 15 millilitres d’acétate d’éthyle.
Mélanger la phase organique et sécher avec du sulfate de sodium anhydre. Retirer le solvant à l’évaporateur sous vide. Pour purifier le produit avec une chromatographie à couche mince, tracez une ligne droite sur la plaque de silice et ajoutez le produit dissous à la ligne.
Mettez la plaque de silice dans le cylindre de chromatographie avec 10 à un PE à EA. Après, dissoudre la silice dans DCM. Retirer la silice du produit par filtration et sécher le DCM à l’aide d’un évaporateur rotatif. Identifiez ensuite le composé par NMR selon le protocole standard.
Ces résultats représentatifs démontrent comment les 4-aryl-1, 2, 3-thiadiazoles et 1, 4, 5, 6-tetrahydropyridazines peuvent être commodément synthétisés par des réactions photocatalytiques catalysées par cercosporin de l’alpha-Halo-N-acyl-hydrazone. La procédure d’acquisition 4-aryl-1, 2, 3-thiadiazoles convient aux substrats portant à la fois des groupes électrons-donneurs et électrons-acceptant dans l’anneau de phényle, fournissant les produits désirés avec des rendements modérés à bons. N’oubliez pas d’utiliser de l’azote et de l’oxygène pour deux catégories différentes de réactions.
