L’ACE est un spectacle d’imagerie optimal. Il prend en charge de le répéter dans l’imagerie in vivo à long terme des cellules d’îlots afin d’étudier leur fonction et leur viabilité dans une situation de greffe. Il peut également être étendu pour étudier d’autres aspects dans des conditions physiologiques et pathologiques en temps réel.
L’avantage de la technique ACE réside dans le fait que les mêmes îlots pancréatiques humains individuels peuvent être suivis de façon non invasive avec une résolution subcellulaire pendant une longue période de temps. Les taux de réussite de la thérapie de remplacement des cellules bêta continuent de s’améliorer. Cependant, l’évaluation de l’efficacité de la greffe d’îlot et de la survie in vivo, reste encore difficile.
Cette méthode pourrait aider à évaluer et à optimiser les résultats des transplantations d’îlots. Cette approche ne se limite pas aux îlots pancréatiques seulement. Il est également bien adapté pour étudier les tissus affectés.
Par exemple, dans les complications diabétiques, comme le glomeruli rénal ou des morceaux de foie, pour n’en nommer que quelques-uns. Pour commencer à placer la souris sur un coussin chauffant chaud, placez-la dans le porte-tête et placez-la sur le masque avant. Utilisez le pouce et l’index pour soulever légèrement la tête.
Attachez-le avec les morceaux métalliques sur les côtés. S’assurer que les morceaux d’oreille fixent la tête directement sous les oreilles. Injectez subcutanément la solution de buprénorphine à l’arrière de la souris.
Rétractez doucement les paupières de l’œil à transplanter à l’aide de forceps contondants. Sortez l’œil et fixez-le lâchement avec une pince à épiler recouverte d’un tube en polyéthène. Après avoir transféré les paupières dans une boîte de Pétri avec PBS, ramasser environ 20 à 30 îlots dans l’œil cannular.
À l’aide d’une aiguille de calibre 25 vers le haut, insérez soigneusement la pointe dans la cornée et faites une seule incision latérale. Soulevez soigneusement la cornée avec la canule préchargée avec des îlots, et relâchez lentement les îlots dans l’œil. Rétractez lentement la canule et appliquez du gel pour les yeux sur l’œil.
Après 10 minutes, retirer les forceps, en tenant la paupière et remettre l’œil à sa position normale. Pour l’imagerie des îlots humains implantés avec deux microscopies photons, placez la plate-forme du porte-tête sous le microscope et administrez le gel oculaire sur l’œil comme liquide d’immersion entre la cornée et la lentille. Placez l’œil sous l’objectif et l’image des îlots humains implantés tels que décrits dans le manuscrit du texte.
Pour supprimer l’autofluorescence, allez à l’onglet traitement d’image, choisissez l’arithmétique du canal et tapez le canal un moins le canal deux. Cela crée un nouveau canal quatre. Renommez-le vasculature.
Répétez ce processus et tapez le canal trois moins canal deux pour créer un nouveau canal cinq et renommer la tomate tout. Pour définir l’îlot créer manuellement une nouvelle surface et choisir de modifier manuellement dans l’assistant. Gardez le pointeur en mode sélectionné et en vue 3D.
Et cliquez sur le volume pour visualiser les sections. Dans l’onglet dessin choisir le contour et cliquez sur dessiner pour commencer à dessiner des contours autour de la bordure de l’îlot, en commençant par trancher la position un. Ensuite, déplacez-vous vers une nouvelle position de tranche et répétez les contours de dessin.
Terminer avec la dernière tranche sur le dessus de l’îlot et terminer en cliquant sur l’onglet créer la surface. Segment suivant, vasculature d’îlot et fluorescence de tomate d’îlot utilisant le masque d’îlot. Choisissez l’objet masque d’îlot précédemment défini, allez à l’onglet édition et cliquez sur le masque tous onglet, qui ouvre une nouvelle fenêtre.
Choisissez le canal vasculature dans le menu dropdown de sélection de canal et activez les options du canal en double avant d’appliquer le masque. Constante à l’intérieur, à l’extérieur et mettre voxels surface extérieure à 0,000 qui crée un nouveau canal six. Renommer cette vasculature d’îlot de canal.
Répétez les étapes précédentes et choisissez la tomate tout dans le menu de dropdown de sélection de canal, pour créer le nouveau canal, le renommer, tomate d’îlot. Créez ensuite une nouvelle surface dans le menu scène et choisissez la création automatique dans l’assistant. Définissez le canal source vers la vasculature d’îlot précédemment créée et choisissez la soustraction d’arrière-plan.
Utilisez en option des filtres. Choisissez par exemple le volume et ajustez le filtre dans la fenêtre, qui peut supprimer certains objets de service. Finissez l’assistant et nommez le nouvel objet de surface, vasculature d’îlot.
Dans l’îlot vasculature objet de service aller à l’onglet d’édition et cliquez sur le masque tous les onglets, qui ouvre une nouvelle fenêtre. Choisissez le canal de tomate d’îlot dans le menu de dropdown de sélection de canal et réglez des voxels en dehors de la surface à 10.000 qui crée un nouveau canal. Renommer ce canal islet tomate vasculature.
Pour segmenter le signal fluorescent capsule tomate choisir l’arithmétique du canal dans l’onglet de traitement d’image et le canal de type sept moins canal huit créant le nouveau canal. Renommez-le capsule de tomate. Créez une nouvelle surface telle qu’elle a été décrite précédemment et choisissez des canaux sources, de la vasculature de tomate d’îlot ou une capsule de tomate dans l’assistant.
Effectuez ensuite la soustraction de fond. Ouvrez le fichier de rétroscètement de l’îlot et créez une nouvelle surface. Dans l’assistant, choisissez la création automatique et définissez la région d’intérêt.
Si nécessaire, ajustez le seuil en intensité absolue. L’objet de surface peut être cliqué sur ou hors tension, pour recouper avec l’intensité correspondante du canal. Une fois terminé fermer l’assistant.
Enfin, effectuez la quantification, sélectionnez un objet de surface créé dans le menu scène et rendez-vous à l’onglet statistiques. Pour récupérer des données détaillées sur le volume, choisissez l’onglet détaillé et sélectionnez les valeurs et le volume spécifiques du menu dropdown. Pour récupérer la valeur totale du volume, allez à l’onglet détaillé et choisissez les valeurs moyennes.
Ce protocole a été utilisé pour transplanter des îlots humains non étiquetés dans la chambre intérieure de l’œil de souris fluorescentes rouges femelles de huit semaines. Un logiciel d’imagerie interactif a ensuite été utilisé pour extraire des données quantitatives des images. Imagerie in vivo fluorescens, les greffes humaines d’îlot ont été compromises par l’interférence significative de l’autofluorescence de tissu qui n’a pas été observée dans les greffes d’îlot de souris.
Pour améliorer le rapport signal/bruit, le canal d’autofluorescence a été soustrait. Ensuite, la limite de l’îlot appelé masque d’îlot et les canaux correspondants ont été définis manuellement. Enfin, la segmentation du signal de tomate dans la vasculature des paupières et la capsule des paupières et le rendu final de la surface ont été utilisés pour extraire des données quantitatives.
Ici en tant que session longitudinale représentative d’imagerie de la même greffe humaine d’îlot à deux semaines, deux mois, cinq mois et huit mois après transplantation. Des images MIP de données brutes enregistrées à l’origine, d’images traitées après l’enlèvement de l’autofluorescence de l’îlot et d’un îlot segmenté sont affichées. Lors de l’injection de paupières, assurez-vous de précharger les îlots dans un petit volume et d’utiliser des bras souples à double lumière sur votre microscope stéréo, pour mettre en évidence l’espace de la chambre des yeux afin d’injecter avec succès les îlots dans l’ACE.
Après l’imagerie in vivo, les yeux peuvent être fixés et étudiés plus avant pour la coloration des anticorps et l’histologie conventionnelle. Cette technique est très utile pour les études fonctionnelles des îlots humains individuels en temps réel et dans des conditions physiologiques, en particulier dans le contexte de la vascularisation, la viabilité et les études métaboliques.
