Ce protocole peut aider à comprendre les mécanismes de protection contre les attaques auto-immunes et à identifier des cibles thérapeutiques pour le remplacement des cellules bêta dans le diabète de type un. Le principal avantage de cette technique est le coût relativement faible, la simplicité des méthodes de culture cellulaire, de transplantation et d’imagerie, ainsi que le caractère invasif minimal des techniques de souris. Les personnes qui n’ont jamais effectué d’injection veineuse de la queue auparavant peuvent avoir du mal à insérer l’aiguille dans la veine.
Demandez une démonstration par un expert avant votre première injection. Pour commencer, prenez la souris anesthésiée et retirez les poils de sa face dorsale à l’aide d’un rasoir électrique avec un garde, exposant environ un pouce sur deux pouces de la peau. Remettez la souris rasée dans la chambre de retournement.
Avant la greffe, transférez une souris à la fois de la chambre à une surface propre équipée d’un cône nasal d’isoflurane et guidez doucement la tête de la souris dans le cône nasal. Essuyez la zone rasée avec un tampon de préparation à l’alcool isopropylique pour enlever les poils lâches et désinfecter la peau. Ensuite, aspirez plus de 300 microlitres de suspension cellulaire dans une seringue stérile d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 26.
Retirez les bulles de la seringue et retenez 300 microlitres de suspension cellulaire tout en expulsant l’excès. À l’aide d’une paire de pinces incurvées tenues dans la main non dominante, soulevez doucement la peau d’un côté du dos de la souris pour permettre un accès plus facile à l’espace sous-cutané. Ensuite, à l’aide de la main dominante, placez la seringue parallèlement aux plaines coronales et sagittales du corps de la souris.
Avec l’aiguille pointée vers la tête de la souris, insérez-la dans la peau près des quartiers postérieurs et guidez-la dans l’espace sous-cutané tout en vous assurant que l’aiguille entière reste sous la peau et ne perce pas. Ajustez les forceps pour maintenir la peau autour de la base de l’aiguille. Distribuez lentement moins de 50 microlitres de la suspension cellulaire et confirmez la formation d’un petit renflement sous la peau au site de l’injection.
Continuez à injecter jusqu’à 200 microlitres de suspension cellulaire par voie sous-cutanée. Ensuite, en tenant la pince en place et en gardant l’aiguille parallèle au corps de la souris, retirez l’aiguille. Une fois l’aiguille retirée, maintenez la peau fermée avec une pince pendant quelques secondes pour empêcher les cellules de s’échapper de la plaie perforante.
Après la greffe, transférez chaque souris dans une nouvelle cage et permettez à l’animal de se remettre complètement de l’anesthésie avant d’ajouter des souris supplémentaires à la cage. En plaçant la souris euthanasiée sur son dos, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision verticale d’environ deux pouces de long dans la peau. Coupez le côté droit de la souris et localisez la rate rouge vif.
Coupez doucement la rate loin du pancréas rose et transférez-la dans une boîte de Petri stérile de 10 centimètres contenant cinq millilitres de PBS stérile. Écraser la rate avec le dessus plat d’un piston de seringue stérile. Placez une passoire de 40 ou 70 microns sur un tube conique de 50 millilitres et amorcez-la avec cinq millilitres de PBS.
Transférer la suspension de rate dans la passoire et l’écraser doucement. Lavez le plat avec 10 millilitres de PBS et transférez le lavage dans la passoire. Poursuivre l’écrasage jusqu’à ce qu’il ne reste plus de couleur rouge sur la passoire.
Faites ensuite tourner le tube à une vitesse de 500 G pendant cinq minutes à température ambiante et retirez le surnageant avec une pipette d’aspiration avant de remettre en suspension la pastille cellulaire dans cinq millilitres de tampon de lyse ACK préchauffé à température ambiante pour effectuer la lyse des globules rouges à température ambiante pendant quatre minutes. Éteignez la réaction avec cinq millilitres de milieu cellulaire NIT-1 par cinq millilitres de tampon de lyse et passez la suspension cellulaire dans un tube centrifuge de 50 millilitres à travers une crépine fraîche pour éliminer les touffes. Faire tourner le tube à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, remettez en suspension la pastille de cellule dans 20 millilitres de PBS avant de compter les cellules. Après le comptage, faites tourner les cellules à 500 G pendant cinq minutes à température ambiante. Remettez en suspension la pastille cellulaire dans du PBS stérile dans un tube de réaction à verrouillage sécuritaire de 1,5 millilitre.
Injectez immédiatement ou stockez les cellules sur de la glace pendant un maximum d’une heure. Réchauffez le corps des souris NOD SCID adultes en utilisant une lampe chauffante pendant cinq à 10 minutes pour vasodiler les veines. Remettez en suspension la solution splénocytaire avant chaque injection.
Pour chaque souris, aspirez 100 microlitres de la suspension de splénocytes préchauffée dans la seringue, assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente. Ensuite, placez la souris dans le dispositif de retenue avant de capturer sa queue avec la main non dominante. Localisez l’une des deux veines latérales de la queue.
Faites tourner doucement la queue si nécessaire. Essuyez la queue avec une lingette désinfectante contenant 70% d’alcool isopropylique. À l’aide de la main dominante, insérez l’aiguille à un angle aigu dans la région centrale de la queue.
Avec le biseau de l’aiguille tourné vers le haut, faites glisser l’aiguille de quelques millimètres à travers la peau. Appliquez ensuite une légère pression sur la seringue pour injecter la suspension splénocytes. Ne laissez pas l’aiguille entrer ou sortir plus loin lors de l’injection.
Les injections réussies ne donnent pas lieu à une contre-pression pendant l’injection et sont indiquées par un flux sanguin transparent ou blanc immédiatement après l’injection. Après l’injection, relâchez doucement l’aiguille hors de la veine et appliquez une légère pression sur la queue avec une lingette désinfectante jusqu’à ce que le saignement cesse. Libérez la souris du dispositif de retenue et transférez-la doucement dans une cage fraîchement préparée.
Au moins cinq minutes avant l’imagerie, injecter à la souris par voie intrapéritonéale la dose appropriée de solution de D-luciférine à l’aide d’une seringue d’un millilitre et d’une aiguille de calibre 26. Après vous être connecté au logiciel de création d’images, dans le panneau de configuration, sélectionnez Initialiser. Pour enregistrer automatiquement les données d’imagerie, cliquez sur acquisition suivi de l’enregistrement automatique et créez les dossiers appropriés dans l’ordinateur.
Une fois l’initialisation de l’instrument terminée, réglez le temps d’exposition sur une minute. Placez la souris sur l’instrument d’imagerie en position couchée avec ses membres écartés et guidez sa tête dans le cône de nez. Aplatissez doucement la souris en appuyant sur le centre de son dos avec les deux mains, puis en écartant les mains vers l’extérieur et à l’écart.
Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, sélectionnez acquérir et enregistrer tous les détails pertinents de l’expérience dans la fenêtre contextuelle. Chez deux des trois souris étudiées, le greffon témoin a été détruit au jour 18, comme en témoigne la perte des signaux bioluminescents respectifs. Chez l’autre souris, cependant, la greffe mutante a été détruite tandis que la greffe témoin a survécu, mettant en évidence la variation biologique entre les animaux.
Le signal bioluminescent a été quantifié et la survie du greffon a été rapportée comme le pourcentage du signal bioluminescent résiduel par rapport au signal au premier point temporel. Le rapport des signaux luminescents de la greffe mutante à la greffe témoin pour chaque souris a été utilisé pour visualiser la variation entre les animaux. Avant le transfert de la maladie, les cellules transplantées peuvent se répliquer, ce qui entraîne des greffons élargis visibles à travers la peau.
À l’imagerie, ces greffons présentaient des signaux bioluminescents saturés qui ne pouvaient pas être quantifiés avec précision. Les greffons peuvent être isolés à différents moments pour caractériser les cellules immunitaires infiltrantes, par exemple par cytométrie en flux pour étudier les mécanismes d’attaque auto-immune et de protection des greffons.
