Ce protocole d’injection intracrânienne est significatif parce qu’il permet des injections précises, une surveillance quotidienne et une mesure précise du volume tumoral pour une étude plus efficace des mécanismes de métastase cérébrale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une surveillance en série de la croissance intercrânienne des tumeurs. Jonathan Spehar, associé de recherche diplômé du Sizemore Laboratory, et Anna Bratasz, chercheuse en imagerie de l’Ohio State University Small Animal Imaging Shared Resource, démontreront la procédure.
Avant de commencer la procédure, tordez la serrure de scène sur la perceuse pour permettre à un adaptateur de foreuse et à un foret stérile d’un millimètre d’être insérés dans la perceuse et serrez manuellement les verrous de bits pour verrouiller la perceuse. Fixez la perceuse au cadre stéréotaxique et réglez le taux de livraison de l’injecteur numérique à 0,4 microlitres par minute, avec une cible de deux microlitres. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de pédale, placez la souris anesthésiée sur le cadre et utilisez l’extrémité émoussée d’un applicateur de pointe de coton pour positionner les dents dans l’auge de la barre buccaise.
Appuyez sur la barre d’oreille gauche contre le canthus médial de l’oreille gauche pour stabiliser le crâne et utiliser la vis sur le cadre stéréotaxique pour verrouiller le crâne en place. Ensuite, fixez l’autre côté du crâne avec la barre d’oreille droite de la même manière. Pour faire une fenêtre calvariale, nettoyez le cuir chevelu avec trois solution bêtadine alternée séquentielle et 70% gommages à l’éthanol et utilisez un scalpel stérile pour faire une incision de trois millimètres à travers la peau le long de l’aspect médian central du crâne suivant la ligne de suture sagittale.
Identifier et orienter le foret stérile perpendiculairement au bregma, en s’assurant de réinitialiser l’échelle vernier numérique à zéro et de déplacer le foret de deux millimètres latéralement à la suture sagittale et un millimètre antérieur à la suture coronale. Éloignez la peau de la perceuse et utilisez la vitesse la plus élevée et faites attention aux repères, percez soigneusement un trou d’environ 0,5 millimètre de profondeur, à travers la calvaria, refroidissant le site de forage avec des gouttes de solution saline stérile au besoin. Une fois que la fenêtre calvariale a été faite, soulevez soigneusement la perceuse et retirez la perceuse du cadre stéréotaxique.
Pour l’injection de cellules cancéreuses, fixez l’unité d’injecteur automatique à l’appareil stéréotaxique et chargez les six à huit microlitres de cellules soigneusement résuspendus dans DPBS dans une seringue stérile de Hamilton. Chargez la seringue sur l’injecteur et distribuez un petit volume de solution sur un drapé stérile jetable pour amorcer l’aiguille pour l’injection. Utilisez un applicateur à pointe de coton pour essuyer la seringue avec 70% d’éthanol et aligner la pointe de l’aiguille au centre de la fenêtre calvariale jusqu’à ce qu’elle touche presque le cerveau exposé.
Réinitialisez l’échelle vernier numérique à zéro et insérez lentement l’aiguille dans une profondeur de trois millimètres dans le cerveau. Laissez l’aiguille dans le cerveau pendant au moins 60 secondes avant de sélectionner exécuter sur l’écran de l’injecteur pour commencer la livraison de la cellule au site d’injection. Lorsque toutes les cellules ont été livrées, laissez l’aiguille reposer dans le cerveau pendant au moins trois minutes pour permettre au parenchyme cérébral de s’acclimater à l’injection avant de retirer l’aiguille du cerveau à un taux de 0,75 millimètre par minute.
Pour l’imagerie par résonance magnétique de la charge tumorale, 10 à 20 minutes avant la formation image au moment expérimental approprié, administrer 100 microlitres par 20 grammes d’agents de contraste à base de gadolinium de poids corporel à la souris par injection intraperitoneal standard. Anesthésier la souris après l’injection et placer la souris anesthésiée sur un support chauffant. Placez le support dans un aimant de 9,4 T équipé d’une bobine de surface cérébrale de souris et obtenez une image localisable.
Puis l’image du cerveau de la souris à l’aide d’une séquence rare pondérée T2 et post gadolinium à base de contraste T1 pondéré séquence rare pondérée. Pour mesurer le volume total de tumeur, ouvrez le fichier de données de MRI d’intérêt dans ImageJ et utilisez l’outil de sélection de main libre pour dessiner un contour autour de la tumeur. Ouvrez ensuite l’onglet analyse et sélectionnez la mesure pour obtenir la zone de la région sélectionnée.
Lorsque toutes les tumeurs contenant des tranches pour une souris individuelle à ce moment précis ont été évaluées, exportez les valeurs dans un programme approprié d’analyse de données. Ici, un aperçu représentatif de la quantification de volume de tumeur pour une souris simple au jour 7 et jour 10 injection mammaire de cellules mammaires de tumeur de poteau peut être observé. L’évaluation de 30 tranches par balayage a indiqué que pour cette analyse, au septième jour après injection, cinq tranches ont exhibé un fardeau de tumeur.
Tandis qu’au jour 10, neuf tranches ont exhibé un fardeau de tumeur. La zone de tumeur dans chaque image a été alors mesurée comme démontré, permettant le changement du volume de tumeur pour être suivi au fil du temps. Chaque lignée cellulaire et chaque modèle de souris destinataire est unique et nécessite donc une optimisation du nombre de cellules injectées et du calendrier d’IRM pour assurer la précision de l’imagerie.
Après cette procédure, le cerveau peut être récolté pour essentiellement n’importe quel essai en aval, y compris l’isolement de cellules simples ou l’analyse histopathologique.
