Alors, pourquoi ce protocole est-il important? Eh bien, les métastases cérébrales sont très difficiles à traiter et ce protocole produit un modèle murin cliniquement pertinent avec des tumeurs extracrâniennes minimales. Cette technique permet une analyse objective de la distribution des médicaments et de la réponse des tumeurs intracrâniennes.
Le principal avantage de cette technique est que le modèle est hautement reproductible et que les métastases cérébrales se développent dans un temps relativement court après l’injection. La progression de la maladie est similaire chez les animaux, ce qui permet aux chercheurs de normaliser plus facilement les expériences, les délais de traitement et les critères d’évaluation. Mon conseil pour les débutants est de s’entraîner à utiliser la pince et la seringue tout en regardant à travers le microscope à dissection, en se familiarisant avec les repères anatomiques autour du cou et en pratiquant le protocole en présence d’un vétérinaire.
Commencez par ensemencer les cellules cancéreuses BT-474 à une densité d’ensemencement de deux fois 10 aux six cellules dans un ballon T-75 en utilisant 10 millilitres de milieu de croissance complet et de culture jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 70 à 80% avant l’injection. Le jour de l’injection, jetez le milieu de croissance et lavez la monocouche cellulaire avec du PBS deux fois et ajoutez cinq millilitres de réactif de dissociation de culture cellulaire préchauffé. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes ou jusqu’à ce que les cellules se soient détachées.
Après cinq minutes, retirez le ballon de l’incubateur et tapotez-le doucement pour faciliter le détachement cellulaire. Ajouter cinq millilitres de milieu de croissance complet contenant 10% FBS pour éteindre l’activité du réactif de dissociation. Remettez doucement les cellules en suspension dans la solution en pipetant pour réduire les amas cellulaires.
Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 50 millilitres et centrifuger à 180 G pendant trois minutes à température ambiante. Décanter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de HBSSS sans calcium ni magnésium pour minimiser l’agglutination cellulaire. Centrifuger la suspension cellulaire à 180 G pendant trois minutes à température ambiante Décanter le surnageant pour éliminer le sérum résiduel ou le réactif de dissociation et remettre en suspension la pastille cellulaire dans trois millilitres de HBSS.
Placez une crépine cellulaire de 100 micromètres sur un tube conique frais de 50 millilitres et passez la suspension cellulaire pour éliminer les amas de cellules. Calculer le nombre de cellules viables en utilisant le bleu de trypan et diluer la suspension cellulaire avec HBSS à une concentration cellulaire de 2,5 fois 10 à six cellules par millilitre. Gardez le tube horizontal sur la glace et secouez-le doucement périodiquement pour minimiser l’agglutination.
La suspension cellulaire peut être stockée sur de la glace pendant un maximum de six heures. Souris perforatrice pour l’identification et utilisez des tondeuses électriques pour raser la fourrure de la région du cou. Nettoyez l’excès de poils de la peau exposée à l’aide de ruban adhésif.
Appliquez un lubrifiant oculaire sur les yeux pour éviter le dessèchement. Fixez doucement la souris en accrochant les incisives supérieures à l’aide de fil collé à la planche chirurgicale, puis en collant les pattes avant et postérieures. Cette étape étend le corps et maintient le cou droit pendant la procédure.
Pour la préparation préopératoire de la peau, essuyez le cou avec un antiseptique topique tel que la povidone iodée pour réduire la charge de la microflore cutanée et enlever les poils lâches. Nettoyer du centre de la peau, en travaillant vers l’extérieur pour prévenir la recontamination du site d’incision. Répétez le processus en utilisant de l’éthanol à 70% et effectuez trois cycles alternés d’iode et d’éthanol pour la désinfection.
Vérifiez le réflexe via le test de pincement pour assurer la mort de l’anesthésie avant de poursuivre la procédure. Posez un champ chirurgical stérile sur l’animal. Sous le microscope à dissection, faites une incision verticale de 15 millimètres le long de la ligne médiane au niveau de la région du cou de la souris à l’aide de ciseaux, à partir de cinq millimètres sous la mâchoire jusqu’à l’entrée thoracique.
À l’aide de deux paires de pinces inclinées, séparez la peau et les glandes salivaires sous-jacentes et appliquez des rétracteurs pour maintenir la trachée exposée. À l’aide de deux paires de pinces à angle fin, disséquez carrément le muscle et le tissu adipeux adjacents à la trachée pour exposer la gaine carotidienne droite. La gaine carotide est la couche fibreuse recouvrant l’artère carotide, la veine et le nerf vague communs, et ce faisceau peut être visualisé par l’artère carotide commune rouge vif.
Dégagez un segment de l’artère carotide commune caudale à la bifurcation carotidienne du fascia environnant et séparez-le du nerf vague et des veines. Isoler et éliminer la bifurcation carotidienne des nerfs et du fascia environnants. Positionnez des pinces fines sous l’artère carotide externe et passez une suture de soie 5-0 sous l’artère.
Nœud et resserrer la suture et couper la ligne d’excès. Placez une pince fine sous l’artère carotide commune et passez une suture de soie 5-0 sous l’artère. Nouez un nœud et resserrez la suture à une position proximale au site d’injection proposé.
Couper l’excès de suture, en laissant environ 10 millimètres de la ligne. Coupez et humidifiez une bande d’essuie-glaces jetables à faible peluche d’environ 10 x 5 millimètres. Pliez la bandelette et placez-la sous l’artère carotide au site d’injection proposé.
Cela soutiendra le vaisseau pendant l’injection. Sur l’artère carotide commune rostrale au site d’injection proposé, placez une troisième ligature avec un nœud lâche. Ceci est resserré seulement après l’injection.
Agitez doucement la suspension cellulaire et aspirez 200 microlitres de suspension cellulaire dans une seringue à insuline avec une aiguille de calibre 31. Chargez la seringue dans le pilote de seringue connecté à une pédale d’activation. Fixez une canule fine avec une aiguille de calibre 31 à la seringue et amorcez la ligne.
Vérifiez si l’artère carotide est bien positionnée et pressurisée. À l’aide de deux pinces à angle fin, l’une tendant doucement sur l’extrémité de la première ligature et l’autre tenant l’aiguille de calibre 31, insérez lentement l’aiguille avec le biseau dans la lumière du vaisseau sanguin, en prenant soin de ne pas la percer. Injectez lentement 100 microlitres de suspension cellulaire préparée plus tôt dans l’artère carotide commune à 10 microlitres par seconde.
Cela livrera 2,5 fois 10 aux cellules cinquièmes dans le vaisseau sanguin. Une injection réussie peut être visualisée via l’élimination du sang du vaisseau sanguin carotidien. Soulevez et serrez doucement la ligature lâche immédiatement après le retrait de l’aiguille pour éviter le reflux et les saignements.
Coupez les sutures en excès et retirez le morceau d’essuie-glaces jetables humidifiés à faible peluche. À l’aide d’une pipette P-200, rincer la cavité chirurgicale deux fois avec 150 à 200 microlitres d’eau stérile ou de solution saline. Après avoir vérifié s’il y a des saignements, repositionnez les tissus mous, les glandes salivaires et la peau sur l’artère carotide et la trachée.
Fermez la couche cutanée de l’incision à l’aide d’un porte-aiguille de suture, d’une pince et d’une suture monofilament 6-0 résorbable ou non résorbable selon un schéma continu. Injecter 50 microgrammes par kilogramme de buprénorphine et un milligramme par kilogramme de méloxicam par injection sous-cutanée comme soulagement de la douleur post-chirurgicale. Déplacez l’animal dans une cage chaude et propre pour récupérer de l’anesthésie.
La lectine a été injectée dans l’artère carotide commune des souris avec ou sans ligature de l’artère carotide externe. Une réduction de la lectine a été observée dans les tissus des joues lorsque l’artère carotide externe a été ligaturée. Les résultats ont montré que la ligature n’avait pas d’impact sur l’accouchement cérébral.
La progression tumorale a été surveillée à l’aide de la lignée cellulaire de cancer du sein amplifiée par la luciférase et amplifiée par HER2. Le modèle de métastases cérébrales BT474 a montré une augmentation des signaux bioluminescents à partir de la cinquième semaine post-injection de carotides internes et a progressivement augmenté par la suite. De la cinquième à la huitième semaine, l’intensité du signal hétérogène indiquait une tumeur intracrânienne avec perfusion liquidienne complexe.
La concentration de gadolinium dans la région tumorale a augmenté à mesure qu’elle fuyait de la circulation sanguine dans le tissu tumoral. L’accumulation de nanomédecine et de métastases cérébrales a été confirmée chez les souris BT-474 par des niveaux de nanomédecine plus élevés détectés dans la région tumorale par rapport aux régions cérébrales non impliquées. Au fur et à mesure que le modèle de métastases cérébrales BT-474 progressait, les animaux ont commencé à perdre jusqu’à 20% de poids corporel, ce qui rend le temps de survie médian de neuf semaines après l’injection.
Les résultats histologiques ont montré que les tumeurs étaient localisées unilatéralement, correspondant au site d’injection carotidienne où les tumeurs apparaissaient principalement comme des masses solides et solitaires. Des poches d’espaces vides ont été fréquemment observées et constituées de cellules nécrotiques, tandis que des excroissances plus petites étaient également présentes chez certains animaux. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative du protocole est de préparer et de positionner correctement l’artère carotide avant d’insérer l’aiguille, puis d’appliquer une tension appropriée lors de l’insertion de l’aiguille.
Ce modèle est utile pour les chercheurs qui explorent l’administration de médicaments au cerveau et l’efficacité des nouveaux traitements pour le traitement des métastases cérébrales.
