Nous décrivons un protocole pour disséquer, immunocolorer et monter les cerveaux des larves et des drosophiles adultes, en mettant l’accent sur les lobes optiques. Compte tenu de l’organisation tridimensionnelle complexe du lobe optique, on s’attend à ce que le protocole décrit ici permette aux chercheurs de mieux comprendre la relation entre l’orientation du montage et les structures du lobe optique visualisées. Ce protocole décrit trois stratégies de montage pour les lobes optiques larvaires et adultes, chacune offrant un angle optimal pour visualiser une structure de lobe optique spécifique pendant l’imagerie.
Avant de commencer la dissection, remplissez tous les puits d’une plaque à trois puits avec 400 microlitres de PBS par puits, et à l’aide d’une pince, sélectionnez délicatement 15 larves errantes du troisième stade qui rampent à l’intérieur d’une fiole ou d’une bouteille de drosophile. Placez toutes les larves dans le premier puits de la plaque à trois puits et transférez une larve dans le puits du milieu de la plaque. À l’aide de la main non dominante, retenez le corps de la larve à la base du puits et utilisez la main dominante pour saisir doucement le crochet de la bouche de la larve.
Retirez le crochet buccal du corps pour retirer le cerveau. Par la suite, retirez les tissus accessoires, y compris les disques imaginaux. Placez ensuite le cerveau dans le troisième puits de l’assiette.
Lorsque tous les cerveaux ont été disséqués, utilisez une pipette P200 pour retirer soigneusement le PBS du troisième puits, en laissant juste assez de solution pour garder le cerveau immergé. Ajoutez 500 microlitres de solution de fixation à froid fraîchement préparée dans le puits. Mélangez doucement la solution avec la pince pour que le cerveau tourbillonne dans le plat et couvrez le puits avec une lame de microscope en verre.
Placez ensuite le plat sur de la glace pendant 30 minutes pour fixer le mouchoir. Lavez la cervelle cinq fois avec 400 microlitres de PBS frais plus un triton par lavage. Le cerveau est maintenant prêt pour l’incubation primaire des anticorps.
Pour les dissections cérébrales adultes, anesthésiez 10 à 15 mouches adultes et placez-les sur une lingette de laboratoire sur de la glace. À l’aide d’une pince, transférez doucement une mouche adulte par l’aile dans un puits d’une plaque de dissection à trois puits contenant 400 microlitres de PBS. Utilisez une paire de pinces dans la main non dominante pour maintenir le thorax de la mouche contre la base du puits, et utilisez des pinces ultra fines avec la main dominante pour retirer doucement la tête du reste du corps.
Jetez le corps sur une lingette de laboratoire avec la main non dominante et utilisez la main dominante pour maintenir la tête contre la base du puits près de la trompe. Utilisez les deux pinces pour décoller chaque région de la cuticule entre les yeux, jusqu’à ce que le cerveau soit exposé, et retirez tous les tissus accessoires qui restent attachés au cerveau. Placez le cerveau nettoyé dans le troisième puits et disséquez le cerveau suivant comme indiqué, jusqu’à ce que 15 cerveaux aient été obtenus, ou qu’une période de dissection maximale de 30 minutes se soit écoulée.
Fixez les cerveaux avec 500 microlitres de solution de fixation pendant 20 minutes à température ambiante, et lavez les cerveaux cinq fois avec du PBS plus du triton, comme démontré. Les cerveaux adultes sont maintenant prêts pour l’incubation primaire des anticorps. Remplacez le dernier lavage par deux gouttes de support de montage fluorescent pour immerger le cerveau, et ajoutez une seule goutte de support de montage au centre d’une nouvelle lame de microscope en verre.
À l’aide d’une pince, saisissez chaque cerveau larvaire par le cordon nerveux ventral pour le transfert sur la lame. Pour visualiser les progéniteurs et les neurones de la région centrale du centre de prolifération externe, la lame ou le bouchon lobula, assurez-vous que le cordon nerveux ventral fait saillie sur les lobes, placez les cerveaux larvaires sur la lame avec la face antérieure du tissu vers le haut. Pour visualiser les cellules appartenant aux extrémités des centres de prolifération externes ou internes, assurez-vous que le cordon nerveux ventral fait saillie sous les lobes.
Placez les cerveaux larvaires sur la lame avec la face postérieure du tissu vers le haut. Pour visualiser le croissant des neurones des centres de prolifération interne et externe dans l’axe ventral dorsal et latéral médial, utilisez une paire de pinces pointues ou une aiguille en tungstène pour fendre les lobes du cerveau à travers le cordon nerveux ventral, en commençant par le point de clivage entre les lobes. Réorientez chaque lobe avec le côté latéral vers le haut.
Lorsque les cerveaux des larves ont été correctement orientés, placez une petite goutte de support de montage de chaque côté du cerveau. Placez un feuillet de recouvrement sur chaque goutte et placez un dernier feuillet de recouvrement sur les cerveaux de sorte que les bords droit et gauche reposent sur les deux autres feuillets, formant un pont de couvercle. Ensuite, utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords du pont de recouvrement afin de fixer les cerveaux montés.
Après le dernier lavage secondaire des anticorps, effectuez un dernier lavage avec 400 microlitres de PBS. Remplacez le PBS par trois gouttes de support de montage fluorescent pour immerger le cerveau. Ajoutez une goutte de support de montage dans les tiers gauche et droit d’une lame de microscope en verre.
Placez une lamelle sur chaque goutte pour construire un pont de couverture. Scellez les bords extérieurs de la lamelle de recouvrement droite avec du vernis à ongles et ajoutez une seule goutte de support de montage entre les lamelles. À l’aide d’une pince, transférez doucement les cerveaux sur la lame avec une prudence supplémentaire pour éviter d’endommager les lobes optiques.
Pour visualiser les corps cellulaires des neurones de la lame et de la moelle, utilisez une aiguille en tungstène pour orienter le cerveau en position antérieure avec les lobes de l’antenne dépassant vers l’extérieur. Pour visualiser les neurones du complexe lobula, orientez les cerveaux dans un postérieur avec les lobes antennaires tournés vers le bas contre la position de glissement. Pour visualiser tous les neuropixels du lobe optique dans un seul plan, orientez les cerveaux en position horizontale, alignez les cerveaux dans une monture antérieure, puis utilisez une aiguille de tungstène pour faire pivoter chaque cerveau de 90 degrés vers le haut afin qu’il repose sur sa face ventrale, reposant sur le bord de la lamelle.
Lorsque les cerveaux adultes ont été correctement orientés, placez une dernière lamelle sur les cerveaux de sorte que les bords droit et gauche se chevauchent avec les deux autres lamelles pour former un pont, scellez la lame avec du vernis à ongles. Voici une image d’un lobe optique larvaire dans l’orientation de montage antérieure. Dans l’orientation montante antérieure, l’épithélium du centre central de prolifération plus forte, le neuroblaste de la moelle et les neurones de la lame apparaissent à la surface comme des bandes de cellules qui s’enroulent autour du cerveau.
Plus profondément dans le cerveau, au milieu de la pile Z, l’épithélium du principal centre de prolifération externe et ses neuroblastes et neurones respectifs sont visibles. De plus, l’épithélium du centre de prolifération interne et les neurones du bouchon lobula sont visibles dans ces tranches intermédiaires. Les tranches Z les plus profondes représentent l’autre côté du cerveau où se trouvent les extrémités postérieures du centre de prolifération externe.
L’extrémité superficielle du centre de prolifération interne est également présente. Notons qu’il s’agirait des premières structures visibles si le lobe optique était monté à l’arrière. Voici une image d’un lobe optique monté sur son côté.
À la surface du support latéral, le croissant de la lame est visible et le croissant du bouchon lobule est situé entre ses bras. Le croissant neuronal de la moelle apparaît à une position Z légèrement plus profonde. Voici une image d’un lobe optique adulte monté dans une orientation antérieure.
Comme la moelle est située à la surface de la monture antérieure, le cortex rachidien est immédiatement visible. Les corps cellulaires du cortex projettent leurs arborisations dans le neuropil, qui peut être visualisé à une position Z intermédiaire. C’est également à ce niveau que se trouve le lobule de la lobule, orienté perpendiculairement à la moelle.
À la position Z la plus profonde, le dernier neuropil du lobe optique, la plaque lobula est visible. Notez que la plaque lobula serait la première structure visible dans une monture postérieure. Voici une image d’un lobe optique adulte monté dans une orientation horizontale.
Lorsque le cerveau est retourné de 90 degrés sur le côté en position horizontale, tous les neuropixels et cortex du lobe optique sont visibles dans un seul plan. Lors de l’exécution de ce protocole, la chose la plus importante à retenir est de garder le tissu cérébral immergé dans la solution tout au long du protocole. Si les cerveaux sont exposés à l’air, la qualité de la coloration et, par conséquent, des images finales seront considérablement réduites.
Il est important de comprendre comment l’orientation du montage affecte la visualisation des lobes optiques pour l’imagerie en direct. Les cerveaux larvaires et adultes peuvent être cultivés et imagés pendant plusieurs jours pour suivre les divisions cellulaires ou les changements de votre propre morphologie. Ici, l’orientation du montage est critique, car les types de cellules d’intérêt doivent être proches de la lamelle pour une détection optimale du signal fluorescent in vivo.
