Ce travail a été soutenu par une bourse Ehrman à HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund pour la recherche médicale postdoctorale bourse de JJR, des subventions du NIH F32EY016309 au format DV, Bourse de Thèse Université de New York doyen de DJ, NIH GrantR01 EY13010 de CD et une bourse de recherche DFG à JR (RI 2208/1- 1). Nous remercions Nina Vogt et Pamela Boodram des commentaires sur le manuscrit.

1. Introduction Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes de développement définis: le troisième stade larvaire, la midpupal et le stade adulte. Bien que notre protocole fonctionne aussi pour d&#39;autres stades nymphal (pour plus de détails sur les étapes précédentes, voir 16), nous avons choisi la scène midpupal, comme il est optimal pour l&#39;imagerie tous les PR dans un plan focal et leurs noyaux sont facilement identifiables, ce qui facilite la visualisation des les modèles d&#39;expression de facteurs de transcription. La dissection des rétines fin nymphe est très similaire à la dissection des rétines adultes. Tout d&#39;abord, nous montrer comment recueillir les larves et les nymphes aux étapes souhaitées. Ensuite, nous expliquons comment obtenir des dissections optimales de larves 17-18, midpupal et rétines adultes. Deuxièmement, nous démontrons comment visualiser développement PR à ces étapes en utilisant la microscopie confocale et immunohistochimie. La période de développement des insectes est dépendant de la température. Afin de faciliter la mise en scène reproductible des larves et des nymphes, nous vous recommandons de soulever tous les stocks de mouche à 25 ° C sous un 12 h/12 ​​h de lumière / obscurité cycle. Troisième stade larvaire: Environ 96 heures après la ponte (à 25 ° C), à la fin du troisième stade d&#39;arrêt d&#39;alimentation des larves et se promener sur les parois du flacon alimentaire, où ils finissent par se nymphosent. Utilisez une brosse douce ou une pince pour enlever délicatement une errance de troisième stade larvaire de la paroi du flacon de nourriture. Pupes de 50% («midpupae &#39;) sont observées environ 48 heures après la nymphose. Pour timing exact, vous pouvez entourer juste formé pupes blanc avec un marqueur sur le flacon de nourriture. Vous pouvez également déplacer les pupes blanc à un nouveau flacon pour obtenir un flacon de mise en scène uniforme (pour la stadification des pupes à l&#39;aide des critères morphologiques, voir 19). Après 48 heures, bien réelsove l&#39;midpupae du flacon à l&#39;aide d&#39;une pince. Les mouches adultes: anesthésier les mouches adultes jeunes (2-5 jours après l&#39;éclosion) sur un pad CO 2. Enlever les têtes à l&#39;aide d&#39;une pince et de les stocker dans un verre bien plat froid contenant du PBS 1x. 3. Procédure Dissection (À propos de 1-2 heures par expérience) Après la collecte du spécimen, les placer dans une goutte de PBS froid sur un plat de dissection Sylgard. Disséquer environ 10-15 rétines par génotype. S&#39;il vous plaît consulter les fiches signalétiques ainsi que la santé environnementale de votre institution et sécurité pour la manipulation des réactifs et du matériel (voir les tableaux à la fin de ce protocole). 1. Disques yeux larvaires Imaginal <ol><li> Localiser l&#39;extrémité antérieure de la larve, qui contient les crochets buccaux. Utilisez une pince à appuyer sur la partie centrale de la larve doucement contre le fond du plat Sylgard. Utilisez another Pince pour saisir les crochets buccaux et tirez doucement et lentement loin du corps. Jeter la partie principale du corps et utiliser les pièces buccales pour maintenir la partie antérieure afin d&#39;éliminer les tissus étrangers à partir des disques imaginaux qui restent attachées au cerveau. </li><li> Transfert du cerveau avec des disques imaginaux en saisissant les crochets buccaux avec une pince à 1x PBS dans une cuve en verre de trois puits. Effectuez l&#39;étape de fixation (étape 4.1.). </li><li> Après fixation, enlever les glandes salivaires, le tissu adipeux et tirez le cerveau loin du disque œil-antennaire imaginale. Pour améliorer l&#39;accessibilité des anticorps &quot;difficiles&quot;, la membrane peripodial, qui se trouve sur la surface de l&#39;épithélium, peut être enlevé en appuyant sur la partie du disque antennaire et le pelage de la membrane de distance avec une broche de dissection. Ensuite, effectuez l&#39;immunohistochimie (étape 5.1.). </li></ol> 2. 50% nymphose / Midpupal Rétines <ol><li> Tenez extrémité postérieure de la coque de nymphose avec une pince.Retirez délicatement la surface antérieure de la coque de nymphose en saisissant la cuticule avec un autre pince et tirer lentement loin de la pupe. Décollez cuticule résiduelle pour exposer la tête. </li><li> Utilisez les conseils forceps »pour percer le sous-jacent, sac mou dans la région dorsale antérieure. Ceci permet d&#39;accéder à la tête. Séparez délicatement la tête du thorax par aspirer lentement la tête avec une pipette P20. Expulser la tête de la pointe de la pipette dans du PBS frais froid 1x et enlever l&#39;excès de tissu; saisir la cuticule tête et retirer trompe. Passez à l&#39;étape de fixation (étape 4.1.). </li><li> Percer le lobe optique avec une broche de dissection pour stabiliser le tissu. Insérer la goupille d&#39;autres dissection entre la lame et la rétine de séparer la rétine de la lame / lobe optique. Effectuer immunohistochimie (étape 5.1.). </li></ol> 3. Yeux adultes <ol><li> Prenez le centre de la capsule postérieure de la tête avec une pince et retirer des pièces buccales (trompe), Tiss graisseue et trachées. </li><li> Prenez la cuticule dorsale tête avec une pince et utiliser l&#39;autre pour séparer les yeux du tissu cérébral en tirant doucement sur le côté. Dans la plupart des cas, la lame, une gaine mince et transparente des neuropile cerveau, restera attaché à la rétine. Il est plus facile d&#39;enlever la lame après fixation. </li><li> Retirer cuticule à la marge œil, mais laisser un petit morceau arrière pour faciliter le transfert de la rétine à des solutions différentes. Effectuer la fixation (étape 4.1.). </li><li> Retirer la lame en le saisissant sur un côté avec une pince et tirant légèrement sur le côté avec les pinces autres sans nuire à la rétine. Retirer cuticule résiduelle, car il pourrait se replier sur la rétine lors du montage. Ces deux étapes sont essentielles pour la visualisation de photorécepteurs, qui, autrement, seraient masqués par la lame et reste de la cuticule pendant le processus d&#39;imagerie. Passez à l&#39;immunohistochimie (étape 5.1.). </li></ol> 4. Fixation et Washing (environ 1 h) <ol><li> Stocker les rétines disséqués dans du PBS 1x dans un plat en verre de trois puits placé sur la glace tout en préparant le fixateur frais (dilué 40 microlitres de solution de formaldéhyde à 37% avec 360 ul de PBS 1x, vortex et stocker de la glace). Nous vous recommandons de procéder à la fixation de protocole et d&#39;éviter les longues périodes d&#39;entreposage sur glace (&gt; 15 min). </li><li> Remplacer 1x PBS avec 200 pi de solution de formaldéhyde à 3,7%. Assurez-vous que le tissu est immergé dans un fixateur. Cela est essentiel, car il ne peut être autrement fixé correctement. Si nécessaire, enlever les bulles d&#39;air et les trachées avec la pince. </li><li> Incuber sur agitateur pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Remplacer fixateur avec 1x PBS et rincer deux fois avec du PBS 1x. Continuer lavage dans du PBS pendant 30 min (le shaker, à la température ambiante). </li><li> Remplacer PBS avec du PBST. Rincer deux fois avec du PBST. </li><li> Procéder à l&#39;enlèvement de la membrane peripodial de disques yeux larvaires (3.1.3.) Et les lamelles de midpupal / adulte rétines &lt;strong&gt; (3.2.3., 3.3.4.). </li></ol> 5. Immunohistochimie <ol><li> Blocage: Remplacer PBS avec 200 pi de sérum normal de 5% dans du PBST et incuber rétines pendant 20 min sur agitateur à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution de blocage avec une solution d&#39;anticorps primaire. Sceller le plat de trois puits avec du parafilm et incuber une nuit sur agitateur à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution avec du PBST et rincer 3 fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum de 1 heure sur agitateur à température ambiante. </li><li> Transfert dans une solution d&#39;anticorps secondaire et incuber dans un plat en verre scellé parafilm et le shaker nuit à température ambiante. </li><li> Remplacer solution d&#39;anticorps avec PBST et rincer trois fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum d&#39;une heure sur agitateur à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés dans du PBST pendant plusieurs jours, mais il est essentiel d&#39;ajouter PBST frais au moins une fois par jour pour les empêcher de se dessécher. </li></ol> 6. Montage <ol><li> Pour le montage rétines larvaires et midpupal, utilisez la P20 pour transférer les rétines au centre d&#39;une lame de verre propre. Retirer l&#39;excès PBST. Utiliser une pince à aligner la rétine en vue de faciliter l&#39;imagerie. </li><li> Ajouter 10 ul de milieu de montage sur le dessus de la rétine. Recouvrez-les délicatement avec un glissement 24x40-1 couvercle et le joint avec du vernis à ongles transparent. </li><li> Pour montage rétines adultes, préparer des «ponts» 20: Ajoutez deux gouttes 5 ul de glycérol à 50% sur les deux extrémités d&#39;un côté verre et recouvrez-les avec des lamelles de 22x22-1 (0,13 à 0,17 mm d&#39;épaisseur). </li><li> Retirez le PBST avec une pipette P20, assurez-vous que les rétines ne se dessèchent pas. Ajouter 20 ul de milieu de montage pour le bien. Utilisez un milieu de montage pour transférer les rétines avec le P20 à la diapositive «pont» en verre. </li><li> Utilisez une pince à orienter (lentilles doivent faire face à la lame de verre) et aligner la rétine afin de faciliter l&#39;imagerie. Si nécessaire, retirer les bulles d&#39;air à la P20. </li><li> Lentementglissement lieu 24x40-1 couvercle (0,13 à 0,17 mm d&#39;épaisseur) d&#39;un côté sur le dessus et sceller les bords avec vernis à ongles ou du scotch. Conserver les échantillons à 4 ° C dans une boîte lame de microscope économiseur (garder dans le noir). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs A titre d&#39;exemple de l&#39;application de ce protocole, nous montrons des résultats représentatifs pour visualiser la différenciation des photorécepteurs dans les trois stades de développement dans la vidéo. Une larve eye-antennaire disque et une rétine midpupal ont été colorés avec des anticorps qui étiqueter types différents photorécepteurs au cours de leur développement (figure 1A, B) et une rétine adulte a été coloré avec des anticorps Rhodopsin deux sous-types de visualiser deux photorécepteurs (figure 1C).

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

1. Dépannage D&#39;après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main 21 par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils. Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs e...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS1x, pH 7,4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Préparer la solution mère 10x 20. Diluer avec de l&#39;eau distillée pour obtenir PBS 1x et stocker à température ambiante. Laisser refroidir dans la glace avant dissections. </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Attention: Irritant Porter des gants. Préparer 50 ml 1xPBS avec 0,3% de Triton X-100 (PBST). Conservez-la à température ambiante. </td></tr><tr><td> Solution de formaldéhyde à 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Attention: toxique, cancérogène probable pour l&#39;homme Porter des gants. Avant l&#39;étape de fixation, fraîchement préparer une solution à 3,7% dans une hotte en diluant avec du PBS, magasin sur la glace. </td></tr><tr><td> 5% de sérum normal de cheval </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Préparer 5% v / v de dilution dans du PBST. Conservez-la à quatre degrés. </td></tr><tr><td> Les anticorps primaires et secondaires (p. ex âne anti-mouton Alexa Fluor 488, Donkey anti-lapin Alexa Fluor 555, âne anti-souris Alexa Fluor 647) </td><td> Les sondes moléculaires Invitrogen </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Diluer Anticorps secondaires 1:800 dans du PBST et conserver à quatre degrés. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> Diluer à 1:100 dans une solution d&#39;anticorps secondaire. </td></tr><tr><td> Réactif Slowfade Antifade Or </td><td> Les sondes moléculaires Invitrogen </td><td> S36936 </td><td> Milieu de montage. Conserver à -20 degrés. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Pour le montage. Préparer 10 ml de dilution à 50% avec de l&#39;eau, magasin distillée à la température ambiante. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Pour anesthésier les mouches adultes. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Deux pinces pointues (Dumont # 55) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Kit élastomère silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Préparer plat dissection Sylgard en remplissant un plat de Petri en plastique avec le mélange Sylgard. </td></tr><tr><td> Trois puits plats dissection de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two broches minuties de dissection (0,1 mm de diamètre) et deux pinholders (12 cm) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Insérer une broche de minuties dans chacun des deux pinholders et plier une des repères pour former un crochet. </td></tr><tr><td> Lamelles de microscope (22x22-1 et 24x40-1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope (25x75x1.0 mm; préalablement nettoyé) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml microtubes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Effacer vernis à ongles ou du scotch </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitateur orbital </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boîte de support de diapositives </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Pinceau mince </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 et P200 micropipette et de </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Petit seau avec de la glace </td><td></td><td></td><td> Pour refroidir les plaques de verre, ainsi disséquées rétine et les solutions. </td></tr></table>

dissection and immunohistochemistry of larval, pupal and adult drosophila retinas

L&#39;œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d&#39;environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d&#39;environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 3 4. Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux 5: Dans le sous-type &#39;p&#39;, p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type &#39;y&#39;, y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S 6 7 8. Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque 9 et déclenche l&#39;ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies 10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d&#39;importantes modifications morphologiques 15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d&#39;expression finalement rh. Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines ( <strong&gt; Figure 1).

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Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

La<em&gt; Drosophila</emRétine&gt; est un réseau cristallin de type composé d&#39;un petit nombre de types de cellules qui sont produites d&#39;une manière stéréotypée<sup&gt; 1</sup&gt;. De la perméabilité à l&#39;analyse génétique sophistiquée permet l&#39;étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l&#39;accent sur la différenciation des photorécepteurs.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

The compound eye of Drosophila melanogaster consists of about 750 ommatidia (unit eyes). Each ommatidium is composed of about 20 cells, including ...

dissection-immunohistochemistry-larval-pupal-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

25.1K vues.  New York University. La Drosophila est un réseau cristallin de type composé d'un petit nombre de types de cellules qui sont produites d'une manière stéréotypée 1. De la perméabilité à l'analyse génétique sophistiquée permet l'étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l'accent sur la différ...

Vidéo: Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 expression is rarely tissue-specific enough to allow for precise correlation of the circuit with behavioral readouts. To overcome this major hurdle, we recently developed the FINGR method to achieve a more restrictive Gal4 expression in the tissue of interest. The FINGR method has three components: 1) the traditional Gal4/UAS system; 2) a set of FLP/FRT-mediated Gal80 converting tools; and 3) enhancer-trap FLP (ET-FLP). Gal4 is used to define the primary neural circuitry of interest. Paring the Gal4 with a UAS-effector, such as UAS-MJD78Q or UAS-Shits, regulates the neuronal activity, which is in turn manifested by alterations in the fly behavior. With an additional UAS-reporter such as UAS-GFP, the neural circuit involved in the specific behavior can be simultaneously mapped for morphological analysis. For Gal4 lines with broad expression, Gal4 expression can be restricted by using two complementary Gal80-converting tools: tubP&gt;Gal80&gt; ('flip out') and tubP&gt;stop&gt;Gal80 ('flip in'). Finally, investigators can turn Gal80 on or off, respectively, with the help of tissue-specific ET-FLP. In the flip-in mode, Gal80 will repress Gal4 expression wherever Gal4 and ET-FLP intersect. In the flip-out mode, Gal80 will relieve Gal4 repression in cells in which Gal4 and FLP overlap. Both approaches enable the restriction of the number of cells in the Gal4-defined circuitry, but in an inverse pattern. The FINGR method is compatible with the vast collection of Gal4 lines in the fly community and highly versatile for traditional clonal analysis and for neural circuit mapping. In this protocol, we demonstrate the mapping of FLP expression patterns in select ET-FLPx2 lines and the effectiveness of the FINGR method in photoreceptor cells. The principle of the FINGR method should also be applicable to other genetic model organisms in which Gal4/UAS, Gal80, and FLP/FRT are used.

Mapping and Application of Enhancer-trap Flippase Expression in Larval and Adult Drosophila CNS

We describe a Flippase-induced intersectional Gal80/Gal4 repression (FINGR) method, allowing tissue-specific FLP to determine Gal80 expression patterns. Wherever Gal4 and FLP overlap, Gal4 expression is turned on (Gal80 flipped out) or off (Gal80 flipped in). The FINGR method is versatile for clonal analysis and neural circuit mapping.

Application de cartographie et de Enhancer-trap expression flippase dans larvaire et adulte Drosophile SNC

The Gal4/ UAS binary method is powerful for gene and neural circuitry manipulation in Drosophila. For most neurobiological studies, however, Gal4 ...

Recherche

Neurosciences

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear. Since there is no cell line that satisfactorily represents mammalian hair cells, research on hair cells relies on primary organ cultures. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice (Figure 1) 1-6. The utricle is a vestibular organ, and the hair cells of the utricle are similar in both structure and function to the hair cells in the auditory organ, the organ of Corti. The adult mouse utricle preparation represents a mature sensory epithelium for studies of the molecular signals that regulate the survival, homeostasis, and death of these cells.
Mammalian cochlear hair cells are terminally differentiated and are not regenerated when they are lost. In non-mammalian vertebrates, auditory or vestibular hair cell death is followed by robust regeneration which restores hearing and balance functions 7, 8. Hair cell regeneration is mediated by glia-like supporting cells, which contact the basolateral surfaces of hair cells in the sensory epithelium 9, 10. Supporting cells are also important mediators of hair cell survival and death 11. We have recently developed a technique for infection of supporting cells in cultured utricles using adenovirus. Using adenovirus type 5 (dE1/E3) to deliver a transgene containing GFP under the control of the CMV promoter, we find that adenovirus specifically and efficiently infects supporting cells. Supporting cell infection efficiency is approximately 25-50%, and hair cells are not infected (Figure 2). Importantly, we find that adenoviral infection of supporting cells does not result in toxicity to hair cells or supporting cells, as cell counts in Ad-GFP infected utricles are equivalent to those in non-infected utricles (Figure 3). Thus adenovirus-mediated gene expression in supporting cells of cultured utricles provides a powerful tool to study the roles of supporting cells as mediators of hair cell survival, death, and regeneration.

Mechanosensory hair cells are the receptor cells of the inner ear. The best-characterized in vitro model system of mature mammalian hair cells utilizes organ cultures of utricles from adult mice. We present the dissection of the adult mouse utricle, and we demonstrate adenovirus-mediated infection of supporting cells in cultured utricles.

La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

Hearing loss and balance disturbances are often caused by death of mechanosensory hair cells, which are the receptor cells of the inner ear.  Since there ...

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Analyse fonctionnelle du circuit d&#39;alimentation des larves dans Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given their relevance to development and disease, understanding the mechanisms that govern asymmetric stem cell division has been a robust area of study. Because they are genetically tractable and undergo successive rounds of cell division about once every hour, the stem cells of the Drosophila central nervous system, or neuroblasts, are indispensable models for the study of stem cell division. About 100 neural stem cells are located near the surface of each of the two larval brain lobes, making this model system particularly useful for live imaging microscopy studies. In this work, we review several approaches widely used to visualize stem cell divisions, and we address the relative advantages and disadvantages of those techniques that employ dissociated versus intact brain tissues. We also detail our simplified protocol used to explant whole brains from third instar larvae for live cell imaging and fixed analysis applications.

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

This protocol details a streamlined method used to conduct live cell imaging in the context of an intact larval brain. Live cell imaging approaches are invaluable for the study of asymmetric neural stem cell divisions as well as other neurogenic and developmental processes, consistently uncovering mechanisms that were previously overlooked.

Imagerie en direct de<em&gt; Drosophila</em&gt; larves Neuroblastes

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of the nervous system often produce viable larvae and adults that have locomotion defective phenotypes that are difficult to adequately describe with text or completely represent with a single photographic image. Current modes of scientific publishing, however, support the submission of digital video media as supplemental material to accompany a manuscript. Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique for acquiring high-quality digital video of both Drosophila larval and adult phenotypes from a lateral perspective. Video of larval and adult locomotion from a side-view is advantageous because it allows the observation and analysis of subtle distinctions and variations in aberrant locomotive behaviors. We have successfully used the technique to visualize and quantify aberrant crawling behaviors in third instar larvae, in addition to adult mutant phenotypes and behaviors including grooming.

Acquisition of High-Quality Digital Video of Drosophila Larval and Adult Behaviors from a Lateral Perspective

Here we describe a simple and widely accessible microscopy technique to acquire high-quality digital video of Drosophila adult and larval mutant phenotypes from a lateral perspective.

Acquisition de haute qualité vidéo numérique de<em&gt; Drosophila</em&gt; Comportements larvaire et adulte à partir d&#39;un point de vue latéral

Drosophila melanogaster is a powerful experimental model system for studying the function of the nervous system. Gene mutations that cause dysfunction of ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat open surfaces is complex,&#160;including: pausing, turning, and meandering. This complexity in the repertoire of movement hinders detailed analysis of the events occurring during a single crawl stride cycle. To overcome this obstacle, linear agarose channels were made that constrain larval behavior to straight, sustained, rhythmic crawling. In principle, because agarose channels and the Drosophila larval body are both optically clear, the movement of larval structures labeled by genetically-encoded fluorescent probes can be monitored in intact, freely-moving larvae. In the past, larvae were placed in linear channels and crawling at the level of whole organism, segment, and muscle were analyzed1. In the future, larvae crawling in channels can be used for calcium imaging to monitor neuronal activity. Moreover, these methods can be used with larvae of any genotype and with any researcher-designed channel. Thus the protocol presented below is widely applicable for studies using the Drosophila larva as a model to understand motor control.

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

The Drosophila larva is a powerful model system to study neural control of behavior. This publication describes the use of linear agarose channels to elicit sustained bouts of linear crawling and methods to quantify the dynamics of larval structures during repetitive crawling behavior.

Utilisation Agarose linéaire Canaux pour étudier<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvaire Ramper Comportement

Drosophila larval crawling is emerging as a powerful model to study neural control of sensorimotor behavior. However, larval crawling behavior on flat ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Une seule étape simple protocole Dissection pour Whole-mount Préparation des adultes<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...