Nous remercions le Professeur Weiguo Zou et S. Kato pour les réactifs et les souris et les membres du laboratoire Zou pour leurs discussions utiles. Nous remercions également le Laboratoire de stomatologie numérisée et le Centre de recherche sur les anomalies craniofaciales du neuvième hôpital populaire de Shanghai pour son aide. Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit &Plateau Disciplines, du fonds SHIPM-mu de l’Institut de médecine de précision de Shanghai, du Neuvième Hôpital populaire de Shanghai, de l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai [JC201809], du projet d’incitation de l’équipe d’innovation de haut niveau pour l’École de médecine de l’Université Jiao Tong de Shanghai , le Fonds de recherche interdisciplinaire du neuvième hôpital populaire de Shanghai, École de médecine de l’université JiaoTong de Shanghai [JYJC201902]. Et L.J. est un chercheur du programme de développement des jeunes talents médicaux exceptionnels, du programme de développement des jeunes « Rising Stars of Medical Talent » de Shanghai et du projet « Chen Xing » de l’Université Jiaotong de Shanghai.

Toutes les méthodes relatives aux animaux décrits ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’École de médecine de l’Université Jiaotong de Shanghai.
1. Élevage de souris de délétion Stat3 spécifiques à l’ostéoclaste
REMARQUE: Les souris Stat3fl/fl ont été obtenues commercialement. Les souris Ctsk-Cre ont été fournies par S. Kato (Université de Tokyo, Tokyo, Japon12). Les souris ont été élevées et maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes (FPS) dans l’établissement pour animaux de l’établissement dans des conditions normalisées.
<ol><li>Associez une souris mâle sexuellement mature à deux souris femelles du même âge. Après 18 jours, vérifiez les contrôles quotidiens pour les nouveau-nés. Séparez les souris femelles gravides et gardez-les seules si nécessaire. Changer les souris mâles entre différentes cages de reproduction si les souris femelles n’étaient pas enceintes dans les 1 mois suivant l’appariement.</li>
	<li>Croiser lessourisStat3 fl/fl aux souris Ctsk-Cre (F0). Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3fl/+; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F1). Utilisez les amorces suivantes : Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Cross mâle de 6 semaines Stat3fl/+; Souris Ctsk-Cre avec des souris femelles Stat3fl/fl. Coupez les queues pour le génotypage et gardez le mâle Stat3 fl /fl; Les souris Ctsk-Cre jusqu’à ce qu’elles soient sexuellement matures, soit environ 6 semaines (F2).</li>
	<li>Cross mâle de 6 semaines Stat3 fl/fl; Souris Ctsk-Cre avec des souris stat3femelles fl/fl (F3). Coupez les queues pour le génotypage et remplacez les vieilles souris reproductrices par des souris plus jeunes à temps (F3+N).</li>
</ol>2. Prélèvement de spécimens
<ol><li>Euthanasier six paires de souris mâles Stat3fl/fl et Stat3Ctsk mâles de 8 semaines séparément avec asphyxie au dioxyde de carbone. NOTA : Le débit de CO2 déplace 30 % du volume de la cage par minute (p. ex., pour une cage de 45 cm x 30 cm x 30 cm, le débit de CO2 est de 40 L/min).</li>
	<li>Placez les souris en décubitus dorsal. Disloquer doucement les articulations bilatérales de la hanche à la main. Utilisez des ciseaux ophtalmiques pour couper la peau verticalement du tibia distal, puis disséquer toute la peau du membre postérieur.</li>
	<li>Couper le ligament articulaire de l’articulation droite de la hanche et de l’articulation du genou avec des ciseaux pour séparer le membre postérieur. Couper le trochanter et la jonction du péroné puis immerger le membre postérieur dans du paraformaldéhyde à 4%. Conservez les membres postérieurs droits pour l’étape 3. Couper de manière appropriée l’os aux deux extrémités pour immerger complètement et fixer la moelle osseuse avec du paraformaldéhyde à 4%.</li>
	<li>Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche gauche et de l’articulation du genou avec des ciseaux, retirez doucement les tissus mous et séparez soigneusement le tibia et le fémur. Plongez le tibia et le fémur séparément dans de l’éthanol à 75%. Conservez les fémurs pour l’étape 4 et les tibias pour l’étape 6. Assurez-vous de garder le trochanter intact.</li>
</ol>3. Préparation de la section de paraffine
<ol><li>Fixer le membre postérieur droit dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Décalcifier: Lavez doucement les échantillons avec 1x PBS pendant 10 min 3 fois. Décalcifier les échantillons dans 15% d’EDTA (150 g d’EDTA dans 800 mL deddH2Oet 100 mL de PBS 10x) avec un décalcificateur ultrasonique pendant 3 à 4 semaines jusqu’à ce que les os puissent être pliés. Remplacer par du liquide décalcifiant frais tous les deux jours.</li>
	<li>Lavez doucement les échantillons 3x avec 1x PBS, puis plongez-les dans de l’éthanol à 75% à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Déshydratation: Le deuxième jour, immerger séquentiellement les échantillons dans de l’éthanol à 95%, de l’éthanol à 100% et du xylène, chacun pendant 1 h deux fois.</li>
	<li>Immerger les spécimens dans 1/2 xylène 1/2 paraffine pendant 30 min. Plongez les spécimens dans de la paraffine à 65 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Embed: Sélectionnez un réservoir d’encastrement approprié pour l’encastrement. Placez le tibia uniformément en dessous. Placez le fémur et le tibia à un angle de 90°. Une fois que la paraffine a été complètement refroidie et solidifiée, retirez-la du réservoir d’encastrement. Numérotez les spécimens et conservez-les à -20 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Couper des sections de 5 μm d’épaisseur en continu à l’aide du microtome. Coupez 20 à 40 sections. Étalez les sections sur de l’eau à 37 °C, adhérez-les aux lames du microscope et faites cuire à 42 °C pendant la nuit.</li>
</ol>4. Micro-CT balayage et analyse
<ol><li>Scannez les fémurs gauches avec un micro-scanner. Résolution: 10 μm; Tension: 70 kV; Courant : 114 μA; Fliter : 0,5 mm Al ; Étape de rotation : 0,5°.</li>
	<li>Reconstruire des images 3D de l’os cortical et de l’os trabéculaire à l’aide du logiciel de support du scanner en suivant les instructions du fabricant. Les ROIs sont dans une largeur totale de 1 mm d’os trabéculaire près du plat distal de croissance et dans une section totale de 1 millimètre de large de l’os cortical au milieu des fémurs.</li>
	<li>Calculer les paramètres quantitatifs de microarchitecture : densité minérale osseuse (DMO), fraction volumique osseuse (BV/TV), épaisseur trabéculaire (Tb.Th.), nombre trabéculaire (Tb.N.), séparation trabéculaire (Tb.Sp.) et épaisseur corticale osseuse (Ct.Th.).</li>
</ol>5. Coloration TRAP
<ol><li>Cuire les sections de paraffine à 65 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Dewax: Plongez les sections dans le xylène pendant 10 min. Effectuez cette étape 3x avec du xylène frais.</li>
	<li>Réhydrater : Immerger les sections séquentiellement dans de l’éthanol à 100 %, de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 70 % et du ddH2O, chacun pendant 5 min deux fois.</li>
	<li>Préparer la solution de coloration à l’aide de la trousse de coloration TRAP en suivant les instructions du fabricant et réchauffer à 37 °C. REMARQUE: La solution de coloration TRAP doit être fraîchement préparée immédiatement avant chaque essai.</li>
	<li>Ajouter une solution de coloration de 50 à 100 μL à chaque échantillon et incuber dans une chambre humide à 37 °C pendant 20 à 30 min. Vérifiez l’état de coloration des ostéoclastes au microscope optique toutes les 5 minutes jusqu’à ce que des ostéoclastes multinucléés rouges puissent être vus. Terminez la réactionavec ddH2 O.</li>
	<li>Contre-tache dans une solution d’hématoxyline pendant 30 s. Créez une couleur bleue stable par immersion dans une solution d’ammoniac à 1% pendant 1 min. Rincer à l’eau du robinet qui coule lentement.</li>
	<li>Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre et séchez pendant la nuit.</li>
	<li>Capturez 3 à 5 champs d’intérêt au microscope. Analyser le périmètre trabéculaire par l’image J: mesurer la longueur de la barre d’échelle (Ls) en utilisant l’outil 'ligne droite' comme L1, puis mesurer la longueur du périmètre trabéculaire en utilisant l’outil 'ligne segmentée' comme L2, la longueur physique (Lp)= Ls*L2 /L1). Comptez le nombre de cellules TRAP-positives avec plus de trois noyaux.</li>
</ol>6. Double étiquetage de calcine et d’alizarine rouge
<ol><li>Préparation de l’échantillon : Injecter par voie intrapéritonéale 20 mg/kg de caltine (1 mg/mL dans une solution de NaHCO3 à 2 %) le jour 0, et 25 mg/kg d’alizarine rouge S (AL, 2 mg/mL dansH2O)le jour 4. Sacrifier des souris le jour 7. Dissocier soigneusement les tibias et fixer dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Déshydratation: Après fixation, lavez doucement les tibias 3x avec 1x PBS. Plongez séquentiellement les éprouvettes dans de l’éthanol à 95 %, de l’éthanol à 100 % et du xylène pendant 5 min deux fois séparément.</li>
	<li>Plongez les éprouvettes dans de l’acétone pendant 12 h, dans 1/2 d’acétone 1/2 résine pendant 2 h, et dans de la résine pure dans un four de séchage pendant la nuit. NOTA : La résine a été préparée à l’aide de résine disponible dans le commerce (p. ex. résine Embed 812) conformément aux instructions du fabricant.</li>
	<li>Incorporer: Ajoutez de la résine pure dans un réservoir d’encastrement de gel de silice approprié et placez les échantillons doucement pour éviter les bulles. Polymériser la résine dans un étuve de séchage à 60 °C pendant 48 h.</li>
	<li>Couper les éprouvettes en sections épaisses de 5 μm en continu à l’avec un microtome rotatif. Conservez le reste des échantillons avec du desséchant à température ambiante.</li>
	<li>Adhérez aux sections avec une pince à épiler dans une goutte de 75% d’alcool. Montez les sections avec des lamaux à l’aide de baume neutre. Capturez le étiquetage de fluorescence rouge et vert avec un microscope à fluorescence.</li>
	<li>Mesurez la largeur entre deux lignes d’étiquetage (Ir.L.Wi), le périmètre trabéculaire monétique (sL.Pm), le périmètre trabéculaire à double étiquette (dL.Pm) et le périmètre trabéculaire total (Tb.Pm). Calculer le taux d’apposition minérale (MAR) et le taux de formation osseuse (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/jours d’intervalle. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+remodeling+in+health+and+disease.">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures.">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li><li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis.">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li><li>Kos, C. 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K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+acid+phosphatase:+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function.">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li><li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts.">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li><li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts.">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li><li>Janckila, A. 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T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin.">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li><li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity.">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li><li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats.">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li><li>Tambutt&#233;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein+labelling+and+electrophysiology:+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification.">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation.">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR/Raptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression.">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts.">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14 (2018).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier le mécanisme et le traitement pharmaceutique des maladies humaines13. Les souris Ctsk-Cre ont été largement utilisées pour les études fonctionnelles des ostéoclastes6. La présente étude a décrit les protocoles des méthodes pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.
<p class="jove_conten...

L’os squelettique est le principal organe porteur du corps humain et est sous la pression de l’environnement interne et externe pendant la marche et l’exercice1. Tout au long de la vie, les os passent continuellement par l’auto-renouvellement, qui est équilibré par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Le processus d’élimination des ostéoclastes des os anciens et de la formation de nouveaux os par les ostéoblastes maintient l’homéostasie et la fonction mécanique du système squelettique2. Une perturbation de l’équilibre peut induire des maladies métaboliques osseuses, telles que l’ostéoporose. L’ostéoporose, qui est causée par une activité ostéoclastique excessive, est répandue à l’échelle mondiale et entraîne des pertes économiques substantielles pour la société2,3,4. Selon le nombre limité de médicaments disponibles pour le traitement de l’ostéoporose et leur risque d’effets indésirables4, il est important de dévoiler les détails de la formation et de l’activité de l’ostéoclaste.
Les ostéoclastes dérivés de la lignée hématopoïétique monocyte/macrophage ont des noyaux multiples (peuvent avoir de 2 à 50 noyaux) et sont grands (généralement supérieurs à 100 μm de diamètre)2. Bien que l’exploration des mécanismes et le criblage des drogues pour des désordres osteoclastic aient été largement améliorés par l’intermédiaire de la culture osteoclast in vitro, les réactions organiques compliquées rendent l’évidence in vivo indispensable pour la thérapie visée. En raison des similitudes génétiques et physiopathologiques entre les souris et les humains, les modèles murins génétiquement modifiés sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques des maladies humaines in vivo6. Le système Cre-loxP est une technologie largement utilisée pour l’édition de gènes de souris et a permis aux chercheurs d’étudier les fonctions des gènes d’une manière spécifique aux tissus/cellules5. La cathepsine K (CSTK) est une cystéine protéase sécrétée par des ostéoclastes qui peuvent dégrader le collagène osseux8. Il est bien accepté que CTSK soit sélectivement exprimé dans les osteoclasts mûrs ; par conséquent, les souris Ctsk-Cre sont considérées comme un outil utile pour les études fonctionnelles des ostéoclastes et ont été utilisées6.
La famille des transducteurs de signaux et activateurs de transcription (STAT) est classique et très importante dans l’immunité et la progression et le développement du cancer7,8. Parmi les sept STATs, STAT3 est signalé comme le plus pertinent pour l’homéostasie osseuse9,10. Plusieurs études in vivo ont rapporté que l’inactivation spécifique de STAT3 dans les ostéoblastes diminue la formation osseuse9,10. Néanmoins, les preuves solides concernant la participation de STAT3 à la formation d’ostéoclastes et au métabolisme osseux in vivo sont encore limitées. Récemment, nous avons fourni des preuves in vivo avec un modèle murin de suppression Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3fl/ fl; Ctsk-Cre, ci-après appelé Stat3Ctsk) que STAT3 participe à la différenciation ostéoclaste et au métabolisme osseux11. Dans la présente étude, nous décrivons les méthodes et les protocoles que nous avions l’habitude d’analyser les changements de la masse d’os, de l’histomorphologie d’os, et de l’anabolisme et du catabolisme d’os des souris Stat3Ctsk afin d’étudier l’influence de la suppression STAT3 osteoclast-spécifique sur l’homéostasie d’os.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>E672002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>80000360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-Cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeCa RapidlyDecalcifier</td>
			<td>Pro-Cure</td>
			<td>DX1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBED 812 RESIN</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Beyotime Biotechanology</td>
			<td>C0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT</td>
			<td>Scanco Medical AG</td>
			<td>&#956;CT 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>10018918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>E675007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>A601889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stat3fl/fl mice</td>
			<td>GemPharmatech Co., Ltd</td>
			<td>D000527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAP staining kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

skeletal phenotype analysis of a conditional stat3 deletion mouse model

Les modèles murins transgéniques sont puissants pour comprendre les gènes critiques contrôlant la différenciation et l’activité de l’ostéoclaste, et pour étudier les mécanismes et les traitements pharmaceutiques de l’ostéoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Crémeurs ont été largement utilisés pour les études fonctionnelles des ostéoclastes. Le transducteur de signal et activateur de transcription 3 (STAT3) est pertinent dans l’homéostasie osseuse, mais son rôle dans les ostéoclastes in vivo reste mal défini. Pour fournir la preuve in vivo que STAT3 participe à la différenciation des ostéoclastes et au métabolisme osseux, nous avons généré un modèle murin de délétion Stat3 spécifique à l’ostéoclaste (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) et analysé son phénotype squelettique. Le balayage de Micro-CT et la reconstruction 3D ont impliqué la masse accrue d’os chez les souris knockout conditionnelles. La souillure de H&E, la double souillure rouge de calcein et d’alizarin, et la souillure acide tartrate-résistante de la phosphatase (PIÈGE) ont été exécutées pour détecter le métabolisme d’os. En bref, ce protocole décrit quelques méthodes et techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique et pour étudier les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo.

Utilisant le protocole actuel, des souris spécifiques osteoclast de suppression Stat3 ont été produites pour étudier l’influence de la suppression STAT3 sur la différentiation osteoclast. Les souris Stat3Ctsk et leurs compagnons de litière de type sauvage (WT) ont été élevés et gardés après le génotypage. Des macrophages de moelle osseuse ont été isolés et cultivés en osteoclasts, et la suppression STAT3 chez les souris Stat3Ctsk a ét?...

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Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Ce protocole décrit une méthode canonique pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo. Cette méthode utilise un modèle murin transgénique et certaines techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique.

Analyse du phénotype squelettique d’un modèle murin de suppression conditionnelle de Stat3

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

4.3K vues.  National Clinical Research center of Stomatology. Ce protocole décrit une méthode canonique pour comprendre les gènes critiques contrôlant l’activité osteoclast in vivo. Cette méthode utilise un modèle murin transgénique et certaines techniques canoniques pour analyser le phénotype squelettique.

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A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Un neuronale et astrocytes de co-culture de dosage pour l&#39;analyse du contenu haute de la neurotoxicité

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

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Biologie

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Analyse du développement d&#39;un phénotype morphologique en fonction de la concentration de protéines dans la levure bourgeonnante

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Détection et analyse de l&#39;ADN dommages souris muscle squelettique<em&gt; In Situ</em&gt; Utilisation de la méthode TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning de contigües Les régions d&#39;un muscle squelettique de souris unique pour l&#39;expression génique et analyses histologiques

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

TRANS-intérieur cellulaire massive Injection de cellules souches embryonnaires conduit à des taux plus élevés de chimérisme

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

Un modèle de souris de l’instabilité lombaire de colonne vertébrale

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...