Wir danken Prof. Weiguo Zou und S. Kato für Reagenzien und Mäuse und den Mitgliedern des Zou-Labors für nützliche Gespräche. Wir danken auch dem Labor für Digitalisierte Stomatologie und dem Forschungszentrum für Craniofacial Anomalien des Shanghai Ninth People es Hospital für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949] unterstützt. Shanghai Summit & Plateau Disciplines, der SHIPM-mu Fonds des Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], das Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong University School of Medicine , der crossdisziplinäre Forschungsfonds des Shanghai Ninth People es Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. Und L.J. ist Ein Gelehrter des Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program und des Projekts "Chen Xing" der Shanghai Jiaotong University.

Alle hier beschriebenen Methoden zu den hier beschriebenen Tieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Shanghai Jiaotong University School of Medicine genehmigt.
1. Züchtung von Osteoklast-spezifischen Stat3-Löschmäusen
HINWEIS: Stat3fl/fl Mäuse wurden kommerziell gewonnen. Ctsk-Cre Mäuse wurden von S. Kato (Universität Tokio, Tokio, Japan12) zur Verfügung gestellt. Die Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen in der institutionellen Tieranlage unter standardisierten Bedingungen gezüchtet und gepflegt.
<ol><li>Paarn Sie eine geschlechtsreife männliche Maus mit zwei gleichaltrigen weiblichen Mäusen. Nach 18 Tagen, überprüfen Sie täglich Kontrollen für Neugeborene. Trennen Sie die schwangeren weiblichen Mäuse und halten Sie sie bei Bedarf allein. Ändern Sie männliche Mäuse zwischen verschiedenen Zuchtkäfigen, wenn die weiblichen Mäuse nicht innerhalb von 1 Monat nach der Paarung schwanger waren.</li>
	<li>Kreuz Stat3fl/fl Mäuse zu Ctsk-Cre Mäusen (F0). Clip die Schwänze für genotypisieren und halten Sie die männlichen Stat3fl /+; Ctsk-Cre Mäuse, bis sie geschlechtsreif sind, was etwa 6 Wochen alt ist (F1). Verwenden Sie die folgenden Primer: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Kreuz 6-Wochen-alte männliche Stat3fl /+;; Ctsk-Cre-Mäuse mit weiblichen Stat3fl/fl Mäusen. Clip die Schwänze für genotyping und halten Sie die männlichen Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre Mäuse, bis sie geschlechtsreif sind, was etwa 6 Wochen alt ist (F2).</li>
	<li>Kreuz 6-Wochen-alte männliche Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre-Mäuse mit weiblichen Stat3fl/fl Mäusen (F3). Schneiden Sie die Schwänze für die Genotypisierung ab und ersetzen Sie die alten Zuchtmäuse rechtzeitig durch jüngere Mäuse (F3+N).</li>
</ol>2. Probensammlung
<ol><li>Euthanisieren Sie sechs Paare von 8 Wochen alten männlichen Stat3fl/fl und Stat3Ctsk Littermate Mäuse getrennt mit Kohlendioxid-Erstickung. HINWEIS: DerCO2-Durchfluss verschiebt 30 % des Käfigvolumens pro Minute (z. B. für 45 cm x 30 cm x 30 cm Käfig beträgt derCO2-Durchfluss 40 L/min).</li>
	<li>Setzen Sie die Mäuse in eine Supine-Position. Dislozieren Sie die bilateralen Hüftgelenke sanft von Hand. Verwenden Sie eine augenheilbe, um die Haut vertikal von der distalen Tibia abzuschneiden und dann die gesamte Haut von der Hintergliedse zu sezieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gelenkband des rechten Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere ab, um die Hinterbeine zu trennen. Schneiden Sie den Trochanter und die Kreuzung der Fibel und tauchen Sie dann die hintere Gliedmaße in 4% Paraformaldehyd ein. Halten Sie die rechten Hinterbeine für Schritt 3. Schneiden Sie den Knochen an beiden Enden angemessen ab, um vollständig einzutauchen und das Knochenmark mit 4% Paraformaldehyd zu fixieren.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gelenkband des linken Hüftgelenks und des Kniegelenks mit einer Schere, entfernen Sie vorsichtig das Weichgewebe und trennen Sie die Tibia und den Oberschenkelknochen vorsichtig. Tibia und Oberschenkelknochen getrennt in 75% Ethanol eintauchen. Halten Sie die Femora für Schritt 4 und Tibiafür Schritt 6. Achten Sie darauf, den Trochanter intakt zu halten.</li>
</ol>3. Paraffin-Sektionsvorbereitung
<ol><li>Fixieren Sie die rechte Hintergliedmaße in 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 48 h.</li>
	<li>Entkalkung: Waschen Sie die Proben mit 1x PBS 10 min 3 mal. Entkalkung der Proben in 15% EDTA (150 g EDTA in 800 ml ddH2O und 100 ml 10x PBS) mit einem Ultraschallentkalkungsmittel für 3 bis 4 Wochen, bis die Knochen gebogen werden können. Ersetzen Sie es jeden zweiten Tag durch frische entkalkende Flüssigkeit.</li>
	<li>Waschen Sie die Proben 3x mit 1x PBS vorsichtig und tauchen Sie sie dann über Nacht bei 4 °C in 75% Ethanol ein.</li>
	<li>Dehydrieren: Am zweiten Tag tauchen Die Proben sequenziell in 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol, jeweils für 1 h zweimal.</li>
	<li>Eintauchen von Proben in 1/2 Xylol 1/2 Paraffin für 30 min. Tauchen Sie die Proben über Nacht bei 65 °C in Paraffin ein.</li>
	<li>Einbetten: Wählen Sie einen geeigneten Einbettungsbehälter zum Einbetten aus. Legen Sie die Tibia gleichmäßig darunter. Legen Sie den Oberschenkelknochen und die Tibia in einem Winkel von 90°. Nachdem das Paraffin vollständig abgekühlt und verfestigt ist, entfernen Sie es aus dem Einbettbehälter. Nummerieren Sie die Proben und lagern Sie sie bei -20 °C über Nacht.</li>
	<li>Schneiden Sie mit dem Mikrotome die 5 m dicken Abschnitte kontinuierlich ab. Schneiden Sie 20–40 Abschnitte. Die Abschnitte auf 37 °C Wasser verteilen, an Mikroskopschlitten kleben und über Nacht bei 42 °C backen.</li>
</ol>4. Micro-CT-Scannen und -Analyse
<ol><li>Scannen Sie die linke Femora mit einem Mikro-CT-Scanner. Auflösung: 10 m; Spannung: 70 kV; Strom: 114 A; Fliter: 0,5 mm Al; Rotationsschritt: 0,5°.</li>
	<li>Rekonstruieren Sie 3D-Bilder des kortikalen Knochens und des Trabeekularknochens mithilfe der unterstützenden Software des Scanners, die der Anweisung des Herstellers folgt. ROIs sind in einer Gesamtbreite von 1 mm Trabecularknochen in der Nähe der distalen Wachstumsplatte und in einem insgesamt 1 mm breiten Abschnitt des kortikalen Knochens in der Mitte der Femora.</li>
	<li>Berechnen Sie die quantitativen Mikroarchitekturparameter: Knochenmineraldichte (BMD), Knochenvolumenfraktion (BV/TV), trabekuläre Dicke (Tb.Th.), Trabeekularzahl (Tb.N.), Trabeekulartrennung (Tb.Sp.) und kortikale Knochendicke (Ct.Th.).</li>
</ol>5. TRAP Färbung
<ol><li>Die Paraffinabschnitte bei 65 °C 30 min backen.</li>
	<li>Dewax: Tauchen Sie die Abschnitte in Xylol für 10 min ein. Führen Sie diesen Schritt 3x mit frischem Xylol aus.</li>
	<li>Rehydratisieren: Tauchen Sie die Abschnitte sequenziell in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 70% Ethanol und ddH2O ein, jeweils für 5 min zweimal.</li>
	<li>Bereiten Sie die Färbelösung mit dem TRAP-Färbeset nach den Anweisungen des Herstellers vor und erwärmen Sie sich auf 37 °C. HINWEIS: Trap-Färbungslösung sollte unmittelbar vor jedem Test frisch zubereitet werden.</li>
	<li>Fügen Sie jeder Probe eine Färbelösung von 50 –100 °L hinzu und in einer 37 °C feuchten Kammer für 20–30 min. Überprüfen Sie alle 5 min den Färbestatus der Osteoklasten unter einem Lichtmikroskop, bis rote mehrkernige Osteoklasten zu sehen sind. Beenden Sie die Reaktion mit ddH2O.</li>
	<li>Gegenfleck in Hämatoxylinlösung für 30 s. Erstellen Sie eine stabile blaue Farbe durch Eintauchen in 1% Ammoniaklösung für 1 min. In langsam fließendem Leitungswasser abspülen.</li>
	<li>Montieren Sie die Abschnitte mit Deckellipsen mit neutralem Balsam und trocknen Sie sie über Nacht.</li>
	<li>Erfassen Sie 3–5 Interessenfelder mit einem Mikroskop. Analysieren Sie den trabekulären Umfang nach Bild J: Messen Sie die Länge des Maßstabsbalkens (Ls) mit dem Werkzeug 'gerade Linie' als L1, und messen Sie dann die Länge des trabekulären Umfangs mit dem Werkzeug 'Segmentlinie' als L2, die physikalische Länge (Lp)= Ls*L2 /L1). Zählen Sie die Anzahl der TRAP-positiven Zellen mit mehr als drei Kernen.</li>
</ol>6. Calcein und Alizarin rot Doppelbeschriftung
<ol><li>Probenzubereitung: Intraperitoneal injizieren 20 mg/kg Calcein (1 mg/ml in 2% NaHCO3 Lösung) am Tag 0 und 25 mg/kg Alizarin rot S (AL, 2 mg/ml in H2O) am 4. Tag. Opfern Sie Mäuse an Tag 7. Die Tibia emittieren vorsichtig und fixieren Sie 4% Paraformaldehyd bei 4 °C für 48 h.</li>
	<li>Dehydrieren: Nach der Fixierung die Tibiae 3x vorsichtig mit 1x PBS waschen. Die Proben sukzessive in 95% Ethanol, 100% Ethanol und Xylol für 5 min zweimal getrennt eintauchen.</li>
	<li>Die Proben in Aceton für 12 h, in 1/2 Aceton 1/2 Harz für 2 h und in ReinemHarz in einem Trockenofen über Nacht eintauchen. HINWEIS: Das Harz wurde aus handelsüblichem Harz (z. B. Embed 812 Resin) gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt.</li>
	<li>Einbetten: Fügen Sie reines Harz in einen geeigneten Kieselgel-Einbettungstank ein und legen Sie die Proben vorsichtig auf, um Blasen zu vermeiden. Polymerisieren Sie das Harz in einem Trockenofen bei 60 °C für 48 h.</li>
	<li>Schneiden Sie die Proben mit einem rotierenden Mikrotom kontinuierlich in 5 m dicke Abschnitte. Den Rest der Proben mit Desiccant bei Raumtemperatur aufbewahren.</li>
	<li>Halten Sie die Abschnitte mit Pinzette in einem Tropfen von 75% Alkohol. Montieren Sie die Abschnitte mit Abdeckungen mit neutralem Balsam. Erfassen Sie die rote und grüne Fluoreszenzbeschriftung mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Messen Sie die Breite zwischen zwei Beschriftungslinien (Ir.L.Wi), einbeschrifteten trabekulären Umfang (sL.Pm), doppelbeschrifteten trabekulären Umfang (dL.Pm) und dem gesamten trabekulären Umfang (Tb.Pm). Berechnen Sie die Mineralappositionsrate (MAR) und die Knochenbildungsrate (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/Intervalltage. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+remodeling+in+health+and+disease.">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li><li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoclast+differentiation+and+activation.">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li><li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures.">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li><li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis.">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li><li>Kos, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP+system+for+generating+tissue-specific+knockout+mouse+models.">Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models.</a> Nutrition reviews. 62 (6), 243-246 (2004).</li><li>Elefteriou, F., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+mouse+models+for+bone+studies-Strengths+and+limitations.">Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations.</a> Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).</li><li>Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+STAT3+in+mediating+the+cell+growth,+differentiation+and+survival+signals+relayed+through+the+IL-6+family+of+cytokine+receptors.">Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors.</a> Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).</li><li>Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revisiting+STAT3+signalling+in+cancer:+new+and+unexpected+biological+functions.">Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).</li><li>Itoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+interleukin-6+family-mediated+Stat3+activation+in+osteoblast+differentiation+and+bone+formation.">A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation.</a> Bone. 39 (3), 505-512 (2006).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteoblast/osteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species.">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription.">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li><li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts.">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130 (5), 811-823 (2007).</li><li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Cre-LoxP+system:+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes.">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li><li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+acid+phosphatase:+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function.">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li><li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts.">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li><li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts.">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li><li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b.">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li><li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations.">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li><li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin.">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li><li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity.">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li><li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats.">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li><li>Tambutt&#233;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcein+labelling+and+electrophysiology:+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification.">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li><li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation.">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li><li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR/Raptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression.">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li><li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts.">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14 (2018).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Genetisch entwickelte Mausmodelle werden häufig für die Untersuchung des Mechanismus und der pharmazeutischen Behandlung menschlicher Krankheiten verwendet13. Ctsk-Cre Mäuse wurden weit verbreitet für funktionelle Studien von Osteoklasten6verwendet. Die vorliegende Studie beschrieb die Protokolle der Methoden zur Analyse des Skelettphänotyps und zur Untersuchung der kritischen Gene, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern.
Hist...

Skelettknochen ist das Haupttragende Organ des menschlichen Körpers und steht unter Druck sowohl der inneren als auch der äußeren Umgebung während des Gehens und der Übung1. Das ganze Leben über gehen die Knochen kontinuierlich durch Selbsterneuerung, die durch Osteoblasten und Osteoklasten ausgeglichen wird. Der Prozess der Osteoklasten, die alte Knochen und Osteoblasten, die neue Knochen bilden, beseitigt, behält die Homöostase und mechanische Funktion des Skelettsystems2. Störungen im Gleichgewicht können Knochenstoffwechselerkrankungen wie Osteoporose auslösen. Osteoporose, die durch übermäßige osteoklastische Aktivität verursacht wird, ist weltweit verbreitet und verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste für die Gesellschaft2,3,4. Nach der begrenzten Anzahl von Medikamenten für osteoporose Behandlung und ihr Risiko von Nebenwirkungen4, Ist es wichtig, die Details der Osteoklastbildung und Aktivität zu enthüllen.
Osteoklasten, die aus der hämatopoetischen Abstammung monozyt/makrophage abgeleitet sind, haben mehrere Kerne (können 2 bis 50 Kerne haben) und sind groß (in der Regel größer als 100 m im Durchmesser)2. Obwohl die Erforschung von Mechanismen und das Screening von Medikamenten auf osteoklastische Störungen durch in vitro Osteoklastkultur weitgehend verbessert wurden, machen die komplizierten organischen Reaktionen in vivo Beweise für die zielgerichtete Therapie unverzichtbar. Aufgrund genetischer und pathophysiologischer Ähnlichkeiten zwischen Mäusen und Menschen werden gentechnisch veränderte Mausmodelle häufig zur Untersuchung der Mechanismen und der pharmazeutischen Behandlung menschlicher Krankheiten in vivo6verwendet. Das Cre-loxP-System ist eine weit verbreitete Technologie zur Mausgenbearbeitung und hat es Forschern ermöglicht, Genfunktionen gewebe-/zellspezifisch zu untersuchen5. Cathepsin K (CSTK) ist eine Cystein-Protease, die von Osteoklasten abgesondert wird, die Knochenkollagenabbauenkönnen 8 . Es ist allgemein anerkannt, dass CTSK selektiv in reifen Osteoklasten exprimiert wird; Daher gelten Ctsk-Cre-Mäuse als nützliches Werkzeug für funktionelle Studien von Osteoklasten und wurden6verwendet.
Der Signalgeber und Aktivator der Transkriptionsfamilie (STAT) ist klassisch und sehr signifikant in der Immunität und Krebsprogression und -entwicklung7,8. Unter sieben STATs ist STAT3 als die relevanteste für die Knochenhomöostase9,10. Mehrere In-vivo-Studien haben berichtet, dass die spezifische Inaktivierung von STAT3 bei Osteoblasten die Knochenbildungverringert 9,10. Dennoch sind solide Beweise für die Beteiligung von STAT3 an der Osteoklastbildung und am Knochenstoffwechsel in vivo nach wie vor begrenzt. Kürzlich haben wir in vivo-Beweise mit einem osteoklastspezifischen Stat3-Löschmausmodell (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, im Folgenden Stat3Ctskgenannt,dass STAT3 an der Osteoklastdifferenzierung und dem Knochenstoffwechsel11beteiligt ist. In der vorliegenden Studie beschreiben wir die Methoden und Protokolle, mit denen wir die Veränderungen der Knochenmasse, der Knochenhistomorphologie und des Knochenanabolismus und katabolismus der Stat3Ctsk-Mäuse analysiert haben, um den Einfluss der osteoklastspezifischen STAT3-Deletion auf die Knochenhomöostase zu untersuchen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>E672002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>80000360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alizarin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonia solution</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-Cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDSA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeCa RapidlyDecalcifier</td>
			<td>Pro-Cure</td>
			<td>DX1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMP-30</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>13600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMBED 812 RESIN</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin solution</td>
			<td>Beyotime Biotechanology</td>
			<td>C0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-CT</td>
			<td>Scanco Medical AG</td>
			<td>&#956;CT 80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>10018918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral balsam</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>E675007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>Sangon biotech Co., Ltd.</td>
			<td>A601889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotary microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stat3fl/fl mice</td>
			<td>GemPharmatech Co., Ltd</td>
			<td>D000527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRAP staining kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td>
			<td>1330-20-7</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

skeletal phenotype analysis of a conditional stat3 deletion mouse model

Transgene Mausmodelle sind mächtig für das Verständnis der kritischen Gene, die osteoklastische Differenzierung und Aktivität steuern, und für das Studium von Mechanismen und pharmazeutischen Behandlungen von Osteoporose. Cathepsin K (Ctsk)-Cre Mäuse wurden weit verbreitet für funktionelle Studien von Osteoklasten verwendet. Der Signalgeber und Aktivator der Transkription 3 (STAT3) ist bei der Knochenhomöostase relevant, aber seine Rolle bei Osteoklasten in vivo bleibt schlecht definiert. Um den in vivo-Beweis dafür zu liefern, dass STAT3 an der Osteoklastdifferenzierung und dem Knochenstoffwechsel beteiligt ist, haben wir ein osteoklastspezifisches Stat3-Löschmausmodell (Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre) und analysierte seinen Skelett-Phänotyp. Mikro-CT-Scanning und 3D-Rekonstruktion implizierten eine erhöhte Knochenmasse in den bedingten Knockout-Mäusen. H&E-Färbung, Calcein und Alizarin rote Doppelfärbung, und tartrate-resistente Säurephosphatase (TRAP) Färbung wurden durchgeführt, um Knochenstoffwechsel zu erkennen. Kurz gesagt, beschreibt dieses Protokoll einige kanonische Methoden und Techniken zur Analyse des Skelettphäpnotyps und zur Untersuchung der kritischen Gene, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern.

Mit Hilfe des vorliegenden Protokolls wurden osteoklastspezifische Stat3-Deletionsmäuse generiert, um den Einfluss der STAT3-Deletion auf die Osteoklastdifferenzierung zu untersuchen. Stat3Ctsk Mäuse und ihre Wildtyp (WT) Littermates wurden gezüchtet und nach Genotypisierung gehalten. Knochenmarkmakrophagen wurden isoliert und zu Osteoklasten kultiviert, und stat3-Deletion bei Stat3Ctsk-Mäusen wurde nachgewiesen (Abbildung 1</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model at JoVE.com

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Dieses Protokoll beschreibt eine kanonische Methode, um die kritischen Gene zu verstehen, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern. Diese Methode verwendet ein transgenes Mausmodell und einige kanonische Techniken, um Skelett-Phänotyp zu analysieren.

Skelett-Phänotyp-Analyse eines bedingten Stat3-Löschmausmodells

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

skeletal-phenotype-analysis-conditional-stat3-deletion-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

4.3K Aufrufe.  National Clinical Research center of Stomatology. Dieses Protokoll beschreibt eine kanonische Methode, um die kritischen Gene zu verstehen, die die Osteoklastaktivität in vivo steuern. Diese Methode verwendet ein transgenes Mausmodell und einige kanonische Techniken, um Skelett-Phänotyp zu analysieren.

Serie: Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Analysis of Skeletal Muscle Defects in Larval Zebrafish by Birefringence and Touch-evoke Escape Response Assays

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular dystrophies1-3, congenital myopathies4,5, and disruptions in sarcomeric assembly6,7, due to high genomic and structural conservation with mammals8. Muscular disorganization and locomotive impairment can be quickly assessed in the zebrafish over the first few days post-fertilization. Two assays to help characterize skeletal muscle defects in zebrafish are birefringence (structural) and touch-evoked escape response (behavioral).
Birefringence is a physical property in which light is rotated as it passes through ordered matter, such as the pseudo-crystalline array of muscle sarcomeres9. It is a simple, noninvasive approach to assess muscle integrity in translucent zebrafish larvae early in development. Wild-type zebrafish with highly organized skeletal muscle appear very bright amidst a dark background when visualized between two polarized light filters, whereas muscle mutants have birefringence patterns specific to the primary muscular disorder they model. Zebrafish modeling muscular dystrophies, diseases characterized by myofiber degeneration followed by repeated rounds of regeneration, exhibit degenerative dark patches in skeletal muscle under polarized light. Nondystrophic myopathies are not associated with necrosis or regenerative changes, but result in disorganized myofibers and skeletal muscle weakness. Myopathic zebrafish typically show an overall reduction in birefringence, reflecting the disorganization of sarcomeres.
The touch-evoked escape assay involves observing an embryo&#39;s swimming behavior in response to tactile stimulation10-12. In comparison to wild-type larvae, mutant larvae frequently display a weak escape contraction, followed by slow swimming or other type of impaired motion that fails to propel the larvae more than a short distance12. The advantage of these assays is that disease progression in the same fish type can be monitored in vivo for several days, and that large numbers of fish can be analyzed in a short time relative to higher vertebrates.

The zebrafish is now an established and powerful tool for modeling muscular dystrophies, congenital myopathies, and related neuromuscular diseases. Birefringence and touch-evoked escape behavior are two common noninvasive assays used to determine the degree of muscular disorganization and locomotive impairment of zebrafish embryos during early development.

Zebrafish (Danio rerio) have become a particularly effective tool for modeling human diseases affecting skeletal muscle, including muscular ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

Erkennung und Analyse von DNA-Schädigungen in Maus-Skelettmuskel<em&gt; In-situ-</em&gt; Verwenden der TUNEL-Methode

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Kryoschneiden von benachbarten Regionen eines einzelnen Maus Skelettmuskel für die Genexpression und histologische Analysen

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding the pathological processes and evaluating new drugs. Here, we introduced a surgically induced lumbar spine instability (LSI) mouse model that develops IDD starting from 1 week post operation. In detail, the mouse under anesthesia was operated by low back skin incision, L3&#8211;L5 spinous processes exposure, detachment of paraspinous muscles, resection of processes and ligaments, and skin closure. L4&#8211;L5 IVDs were chosen for the observation. The LSI model develops lumbar IDD by porosity and hypertrophy in endplates at an early stage, decrease in intervertebral disc volume, shrinkage in nucleus pulposus at an intermediate stage, and bone loss in lumbar vertebrae (L5) at a later stage. The LSI mouse model has the advantages of strong operability, no requirement of special equipment, reproducibility, inexpensive, and relatively short period of IDD development. However, LSI operation is still a trauma that causes inflammation within the first week post operation. Thus, this animal model is suitable for study of lumbar IDD.

We developed a lumbar intervertebral disc degeneration mouse model by resection of L3&#8211;L5 spinous processes along with supra- and inter-spinous ligaments and detachment of paraspinous muscles.

Ein Mausmodell der Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...