La réplication virale du VHB dans l’extrahépatique joue un rôle important dans la pathogénie des syndromes extrahépatiques. À l’heure actuelle, les modèles de culture cellulaire pour commencer l’infection extrahépatique par le VHB sont limités. Nous présentons un modèle in vitro d’infection non hépatique pour aider à identifier de nouveaux facteurs d’hôte qui affectent la réplication du VHB et à étudier les maladies rénales liées au VHB.
Comparé aux modèles traditionnels d’infection de HBV, nous avons adopté et machiné la ligne cellulaire de 293T, 293T-NE-3NR, et l’avons co-cultivé avec HepG2.2.15. L’infection par le VHB devrait être effectuée dans un laboratoire de niveau de biosécurité deux ou de biosécurité de niveau trois. Les pratiques de sécurité en laboratoire devraient être suivies pour assurer la sécurité du personnel de laboratoire et tous les chercheurs devraient être vaccinés et détecter les anticorps HBS positifs avant d’effectuer des expériences sur le VHB.
Commencez par la culture des cellules HepG2.2.15 en gardant à l’esprit que le supernatant cellulaire ainsi que tous les conseils, flacons, plaques et tubes qui entrent en contact avec HepG2.2.15 doivent être trempés dans 2% virucide pendant la nuit avant l’élimination. Retirez le flacon contenant des cellules HepG2.2.15 de l’azote liquide et décongelez-le en tourbillonnant doucement dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Transférer les cellules dans un flacon de culture tissulaire carré de 25 centimètres et ajouter quatre millilitres de milieu de culture complet.
Culture des cellules HepG2.2.15 à 37 degrés Celsius et 5% dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Changez le milieu tous les trois jours. Une fois prêt, recueillir le supernatant cellulaire dans un tube centrifugeuse de 50 millilitres.
Fermez fermement le couvercle et enveloppez-le avec du film de paraffine. Pour enlever les fragments de cellules, filtrez le supernatant HepG2.2.15 avec une membrane de 0,45 micromètre dans un nouveau tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 14 millilitres de supernatant filtré à une colonne de concentrateur de virus et fermez le couvercle.
Centrifugez la colonne à 3 200 g pendant 35 minutes dans une centrifugeuse horizontale et recueillez le concentré de supernatant HepG2.2.15 dans un tube de 1,5 millilitre. Exécutez un PCR en temps réel pour vous assurer que la concentration si l’ADN du VHB dans le concentré de supernatant HepG2.2.15 se trouve dans la plage de courbe standard. Diluer le concentré 20 fois en ajoutant 10 microlitres à 190 microlitres de DMEM dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
Avec le concentré supernatant, préparez un contrôle négatif, un contrôle positif et quatre dilutions de la référence quantitative. Ajouter 450 microlitres de tampon d’extraction d’ADN du VHB à chaque échantillon et les centrifuger à 12 000 fois g pendant cinq minutes à température ambiante. Combinez 27 microlitres de mélange principal PCR et trois microlitres d’enzyme taq polymésase par échantillon dans des tubes PCR placés sur la glace.
Ajouter ensuite 20 microlitres de l’échantillon centrifugé à chaque tube. Effectuez un PCR en temps réel selon les instructions manuscrites et exportez les valeurs CT pour obtenir une courbe standard. Divisez le concentré de supernatant HepG2.2.15 en aliquots et rangez-le à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à l’emploi.
Préparer le milieu d’infection selon les directives manuscrites. Puis les graines HepG2-NE dans deux puits, 293T-NE-3NR cellules dans deux puits, et 293T-NE dans un puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié pendant 24 heures.
Après l’incubation, observez les cellules et procédez à l’infection si elles sont en bonne santé. Ajouter 500 microlitres du complexe d’infection à chaque puits et incuber les cellules pendant encore 24 heures. Lavez les cellules deux fois avec 500 microlitres de PBS.
Ajouter ensuite un millilitre de milieu à chaque puits. Changez doucement le milieu tous les deux jours. Le jour 11, lavez doucement les cellules deux fois avec 500 microlitres de PBS et fixez les cellules avec du méthanol glacé pour l’immunofluorescence.
Graine 100 000 cellules par puits d’HepG-NE en deux puits, 293T-NE-3NRs en deux puits, et 293T-NE dans un puits de la plaque. Graine 100 000 cellules par puits d’HepG2.2.15 en cinq inserts membranaires dans une plaque séparée de six puits. Incuber les cellules pendant 24 heures.
Après l’incubation, assurez-vous que les cellules sont toutes adhérentes et en bon état. Jeter le milieu dans la plaque de six puits et les inserts de la membrane cellulaire. Placez ensuite les inserts membranaires avec HepG2.2.15 dans la plaque de six puits ensemencée avec HepG-NE, 293T-NE-3NRs et 293T-NE.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié, en changeant le milieu tous les trois à quatre jours. Après 10 jours, retirer les inserts membranaires, laver délicatement les cellules avec PBS deux fois, et fixer les cellules avec du méthanol glacé pour l’immunofluorescence. L’incubation avec l’anticorps primaire HBcAg et le DAPI a eu comme conséquence une coloration distincte une fois observée avec un objectif de 10X sur un microscope inversé fluorescent.
La localisation nucléaire a été confirmée par la coloration avec DAPI et l’expression de NTCP-EGFP a été identifiée avec la fluorescence verte. Les sites d’expression de HBcAg ont été localisés avec fluorescence rouge. Lorsque le DAPI, le NTCP et le HBcAg se trouvent dans la même cellule, la cellule a été infectée avec succès par le VHB.
Le groupe Cyclosporin A était le contrôle négatif parce qu’il empêche le VHB d’entrer dans les cellules en bloquant le NTCP. HBcAg a été détecté dans 293T-NE-3NRs, mais pas dans 293T-NE cellules indiquant NTCP n’est pas le seul facteur essentiel pour l’infection par le VHB dans 293T. Un bon état cellulaire et un fonctionnement efficace sont les points clés pour obtenir des résultats d’infection réussis.
Il est également important de laver et de changer les médias après l’infection. Comme alternative, la méthode d’infection par le VHB avec les cellules HepG2-NE à base d’hépatome a une efficacité d’infection plus élevée que cette méthode et convient au dépistage des médicaments anti-VHB. La modélisation de l’infection par le VHB dans 293T-NE-3NR est un complément utile au modèle cellulaire traditionnel en raison de l’arrière-plan non hépatique de ces cellules.
Cette méthode facilitera l’étude de l’infection par le VHB dans les cellules non hépatiques ainsi que les facteurs d’hôte requis pour le foie du VHB.
