Ce travail a été soutenu par des subventions du NIAID (R01AI074951, U54AI057168) et l&#39;Institut Penn Génome Frontières à SC; du NIH T32HG000046 à TSM; du NIH et de T32GM07229 T32AI007324 au LRS.

Partie 1: ARNi dans Plaques 384 puits <ol><li> Standardisation des réactifs utilisés pour le dépistage est essentiel. Nous testons des lots individuels de média de Schneider, sérum de veau fœtal et réactifs de coloration. Ensuite, nous aliquote et utiliser le même lot pour la totalité de l&#39;écran. </li><li> Pour tout dosage, il est préférable de tester plusieurs lignées cellulaires différentes afin de déterminer qui est le plus prête à votre biologiques lecture. Nous utilisons généralement la ligne S2-DRSC. </li><li> Cultiver des cellules de drosophile à 25 ° C dans des milieux complets de Schneider. <ol class="lalpha"><li> Schneider médias </li><li> FBS inactivé chaleur de 10% </li><li> 1X L-glutamine </li><li> 1X Pen / strep antibiotiques </li></ol></li><li> Les cellules de drosophile sont semi-adhérent et sont passées sans trypsination tous les quatre jours par pipetage des cellules hors des flacons et de diluer les cellules dans un flacon de 01h10 fraîche. Les cellules doivent être en phase logarithmique pour des expériences. </li><li> Plate-to-plate et au jour le jour la variabilité sont minimisés par l&#39;utilisation de la manipulation de liquides automatisée pour tous les ajouts liquides pour plaques multi-puits. Nous utilisons un WellMate (Matrix). </li><li> Préparer tube WellMate. <ol class="lalpha"><li> Capote et WellMate avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Retirez l&#39;emballage et du tube de pulvérisation avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Insérez la cassette dans le tuyau de distribution position sur le WellMate. </li><li> Premier tube avec 25 ml d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Stériliser tube dans de l&#39;éthanol pendant 15 minutes, alors premier avec un autre de 25 ml d&#39;éthanol. </li><li> Rincez tube par amorçage avec 50 ml de PBS stérile. </li></ol></li><li> Déloger les cellules du flacon et à compter. Pellet cellules de sorte que vous avez 25% de plus que nécessaire (300xg, 5 min). Le nombre de cellules ensemencées par puits doit être optimisée en fonction de la longueur de dosage. Lors de la réalisation d&#39;analyse d&#39;image automatique, une seule monocouche sans agglutination cellulaire est idéal pour la segmentation d&#39;images. </li><li> Resuspendre culot cellulaire dans un milieu sans sérum de Schneider au 1.7x10 6 cellules / ml. </li><li> Nous effectuons l&#39;écran en 384 plaques ainsi pré-aliquotés avec une bibliothèque disponible dans le commerce d&#39;ARNdb à une concentration de 250ng/well. Plusieurs puits de chaque plaque sont laissés vides pour les contrôles, qui sont ajoutés manuellement. Nous utilisons des ARNdb à la luciférase comme contrôle négatif. Nous utilisons des ARNdb contre-fil (DPAI) comme contrôle pour robustes ARNi. Faites tomber les résultats de ce facteur anti-apoptotique de la mort cellulaire dramatique et est un moyen visuel rapide pour évaluer la qualité de l&#39;assommer. Enfin, nous utilisons un ARNdb contre le journaliste virale, dans ce cas, le bêta-galacosidase, comme un contrôle positif à valider que l&#39;on peut inhiber l&#39;infection virale à l&#39;aide de notre test de lecture. Si spotting ARNdb dans la plaque au moment de l&#39;ensemencement des cellules, une partie aliquote ARNdb ul dans le coin du puits pour permettre la visualisation plus facile, puis centrifuger ARNdb dans le fond du puits (300xg, 1 mn) avant d&#39;ajouter les cellules. </li><li> Utilisez WellMate d&#39;ajouter 10 uL cellules préparé ci-dessus à chaque puits. </li><li> Spin cellules sur des plaques par centrifugation 300xg, 1 min. </li><li> Incuber à 25 ° C incubateur pendant 45 minutes. </li><li> Ajouter 20 uL médias complet de Schneider et centrifuger 300xg, 1 min. </li><li> Plaques Placer dans des contenants Tupperware humidifié bordée de serviettes en papier imbibées d&#39;eau. Le volume d&#39;une 384 est bien petite, ainsi, l&#39;évaporation peut avoir des effets importants sur la biologie, qui à son tour peut conduire à des changements dans les aboutissants artéfactuelle lecture des puits de pointe. Pour y remédier, les plaques doivent être maintenues sous une forte humidité. </li><li> Incuber pendant trois jours pour permettre knockdown robuste. Il n&#39;est pas nécessaire de changer les médias ou d&#39;ouvrir les conteneurs humidifié pendant ce temps. </li></ol> Partie 2: infecter avec le virus vaccine <ol><li> Stériliser multi-canal d&#39;aspiration dans les Quatricide pendant 15 minutes, puis rincer dans de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> Préparer WellMate comme décrit plus haut. </li><li> Préparez le support de Schneider avec 2% de FBS à l&#39;infection par dilution totale des médias 01h05 dans le sérum des médias libres. </li><li> Filtre stock de virus brut par 0,8 um seringue filtre pour éliminer les débris cellulaires ou de l&#39;utilisation de virus purifié. </li><li> Diluer virus de la vaccine dans 2% des médias du sérum de Schneider d&#39;obtenir multiplicité d&#39;infection (MOI) de 2. </li><li> Retirer du PBS à partir de tubes WellMate, et le premier avec des virus dilué jusqu&#39;à ce que le tube est libre de bulles d&#39;air. </li><li> Utilisez stérilisés multi-canal d&#39;aspiration et collecteur à vide pour enlever délicatement les médias à partir des plaques de cellules de drosophile ARNdb-traitée. </li><li> Distribuer 30 virus par puits sur des plaques en utilisant les WellMate. </li><li> Centrifuger 1 minute à plaques 300xg. </li><li> Stériliser tube WellMate. Premier avec 25 ml d&#39;Blea 10%ch, attendre 10 minutes, et le premier avec un autre agent de blanchiment de 25 ml à 10%. </li><li> Premier tube 50 ml d&#39;eau suivi de 50 ml d&#39;éthanol à 70%. Retour tube à son emballage. </li><li> Retour aux plaques contenant Tupperware humidifié. Incuber à 25 ° C pendant 48 heures. </li></ol> Partie 3: Plaques de coloration <ol><li> Fixer les plaques dans 15 uL formaldéhyde à 4% / PBS pendant 10 minutes. Le liquide est retiré à l&#39;aide d&#39;un aspirateur multi-canal et le collecteur d&#39;aspiration à chaque étape. Une fois les plaques ont été fixés, matériel stérile et des réactifs ne sont plus nécessaires. </li><li> Retirer fixer et utiliser WellMate d&#39;ajouter 30 uL PBST (PBS + 0,1% de Triton-X). Incuber 10 minutes et répéter. Utilisez WellMate comme décrit plus haut, sauf le tuyau n&#39;a pas besoin d&#39;être stérilisé. </li><li> Pour détecter l&#39;infection vaccine nous utilisons un journaliste β-galactosidase entraînée par un promoteur précoce / tardif vaccine. </li><li> Retirer les cellules de liquide et laisser incuber dans le bloc (PBST avec 2% de BSA) pendant 10 minutes. </li><li> Diluer l&#39;anticorps primaire dans le bloc, enlever le liquide et ajouter 15 uL d&#39;anticorps à chaque pipeteur répétez bien en utilisant un canal multi-(Matrix). </li><li> Isoler plaques (300xg, 1 mn), couvrir avec un autocollant clair, et incuber à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Retirer anticorps primaire, et d&#39;utiliser les WellMate pour laver les puits dans PBST 3 fois, 10 minutes chacune. </li><li> Diluer anticorps secondaire marqué par fluorescence (FITC) et colorant nucléaire dans le bloc, et ajouter 15 ul de puits à l&#39;aide d&#39;une pipette multi-canaux répéter. </li><li> Incuber les plaques pendant 1 heure à température ambiante, protégé de la lumière. </li><li> Laver les puits de PBST 3 fois, 10 minutes chacune utilisant la WellMate. </li><li> Joint de la plaque avec l&#39;autocollant clair, couvrir et conserver à 4 ° C jusqu&#39;à trois semaines. </li></ol> Partie 4: imagerie et d&#39;analyse d&#39;images <ol><li> Utiliser un microscope automatisé à un grossissement de 20x sur des plaques de l&#39;image. </li><li> Capturez des images de noyaux totale (DAPI) et les cellules infectées (ITCF). Optimiser le temps d&#39;exposition pour chaque canal, afin de maximiser la plage dynamique. </li><li> Peaufinez la fonction mise au point automatique en prenant une pile d&#39;images Z, 1um espacées, qui couvrent les avions au-dessus et en dessous du plan prévu de se concentrer. Une fois le plan de focale optimale se situe, d&#39;ajuster les paramètres de mise au point automatique en conséquence. </li><li> L&#39;image de la plaque entière, capturant au moins trois images par puits dans les deux canaux de Hoechst (DAPI) et le canal du virus (ITCF). Choisissez les sites de plusieurs régions différentes au sein d&#39;un bien afin de capturer des images qui représentent le bien comme un tout. </li><li> Utilisez MetaXpress logiciel pour écrire un journal pour segmenter l&#39;image et utiliser des modules noyaux Comte de calculer le nombre total de cellules positives pour la coloration nucléaire (nombre total de cellules) et l&#39;infection (ITCF) pour chaque plaque. </li><li> Calculer l&#39;infection pour cent (100 cellules * FITC positifs / total) et une transformation logarithmique. </li><li> Pour identifier les candidats, nous utilisons un score Z robuste basé sur la médiane et interquartile de chaque assiette. Cette méthode est insensible aux valeurs aberrantes et des données non symétrique, et fournit ainsi une plus grande puissance dans l&#39;identification, même faible ou modérée frappe 10. Pour chaque plaque, la médiane est soustrait des données log-transformées. Puis les valeurs obtenues sont divisées par 0,74 fois l&#39;écart interquartile (la différence entre les valeurs de la 75 e percentile et le 25 e percentile). Le facteur 0,74 est utilisé pour approcher une distribution normale standard. </li><li> Le score Z robuste est une mesure de distance en écarts-types de la médiane de la plaque. Par exemple, un robuste Z-score de 2 indique l&#39;infection% du puits est ~ 2 déviations standards de la médiane plaque ou p &lt;0,05. </li><li> Analyser le nombre de cellules pour identifier les candidats cytotoxiques. Calculer le score Z robuste de comptages nucléaires. Les candidats ayant une solide Z &lt;-2 dans les écrans dédoublés sont considérés comme cytotoxiques. </li><li> Les puits qui ont un score Z robuste pour une infection pour cent de&gt; 2 ou &lt;-2 dans les écrans de reproduire (p &lt;0,0025), sans cytotoxicité sont considérés comme des candidats potentiels de l&#39;écran principal. </li><li> Candidats positifs sont validés à l&#39;aide des réactifs indépendants. dsRNA sont générés contre les gènes d&#39;intérêt d&#39;une autre région de l&#39;ARNm et testé comme ci-dessus. </li><li> Ces gènes, pour lequel deux dsRNA indépendants ont le même phénotype peut être envisagée pour une étude plus approfondie. </li></ol> Partie 5: images représentatives et interprétation des taux d&#39;infection <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Puits Figure 1. Non infectées ne montrent aucune coloration pour les protéines du virus de la vaccine, tandis qu&#39;un représentant ainsi infectés contient des cellules coloration positive pour la vaccine a exprimé la bêta-galactosidase (ßgal) des protéines, tel que mesuré par immunofluorescence.Virus = vert, les noyaux = bleu. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Logiciel automatisé d&#39;analyse d&#39;images permet de quantifier l&#39;infection dans chaque image en utilisant les paramètres définis par l&#39;utilisateur. Dans une image représentative, le nombre total de noyaux de cellules et le nombre de cellules exprimant des antigènes viraux sont comptés selon la taille et l&#39;intensité de la coloration au-dessus du bruit de fond local. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Knockdown de fil (DPAI) sert de contrôle positif pour l&#39;ARNi déplétion robuste de gènes cibles. Knockdown de ce facteur anti-apoptotique conduit à la mort cellulaire dramatique. Noyaux = bleu. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Knockdown Figure 4. De la luciférase sert de contrôle négatif de l&#39;effet de double brin d&#39;ARN du traitement de l&#39;infection. L&#39;appauvrissement de la luciférase n&#39;a aucun effet sur l&#39;infection par rapport aux cellules non traitée. Virus = vert, les noyaux = bleu. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Knockdown de protéines ßgal sert de contrôle positif pour une réduction de l&#39;infection, car le dosage utilise des niveaux de protéines ßgal comme une lecture de l&#39;infection. Épuisement des résultats ßgal une diminution du pourcentage de cellules infectées. Virus = vert, les noyaux = bleu. <img src="/files/ftp_upload/2137/2137fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. Knockdown des cellulaires facteur Rab5 résulte en une diminution du pourcentage de cellules infectées. Depuis Rab5 est connu pour participer à l&#39;endocytose, ce facteur contribue probablement à l&#39;entrée du virus vaccine. Cela représente une valeur aberrante par exemple de l&#39;écran. Virus = vert, les noyaux = bleu.

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L&#39;échelle du génome de dépistage ARNi chez la drosophile fournit une méthode robuste et efficace pour examiner la composante cellulaire de l&#39;infection virale. Un certain nombre de virus de mammifères infectent les cellules de drosophile, qui peut être utilisé pour identifier les composants de l&#39;hôte réponse immunitaire intrinsèque, et les facteurs de protéine de l&#39;hôte nécessaires à la réplication virale qui peut représenter de nouvelles cibles thérapeutiques. Avant de procéder à un écran, le dosage doit être soigneusement optimisée pour le type de cellule, le nombre de cellules, et le niveau d&#39;infection, et doivent être bien contrôlés, y compris à la fois positifs et négatifs virale et les cibles cellulaires 11. Il est important d&#39;assurer une séparation suffisante entre les contrôles positifs et négatifs avant le dépistage afin d&#39;optimiser la gamme dynamique du dosage. Une fois que l&#39;écran a été effectué, les candidats peuvent être divisés en catégories fonctionnelles afin de déterminer quels sont les mécanismes d&#39;accueil contribuent à l&#39;infection. Pour les virus de mammifères tels que la vaccine, la contribution des homologues chez les mammifères par RNAi devraient être déterminés dans le cadre d&#39;une analyse secondaire. Pris ensemble, ces méthodes de dépistage robustes va nous permettre de mieux comprendre les mécanismes complexes par lesquels les virus interagissent avec leurs cellules hôtes.

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		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>Cell culture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Schneider&#x2019;s media</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>11720</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GlutaMAX 100X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>35050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin (pen/strep)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GIBCO</td>
<td>15140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIGMA</td>
<td>F6178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Screening</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Genome-wide dsRNA library</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>384 well plates, black with clear bottom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3712</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aluminum seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>6569</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Clear seals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Denville</td>
<td>B1212-4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Well Mate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Matrix</td>
<td>201-10001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>24 pin manifold</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond</td>
<td>3-000-101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hoechst 33342</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>B2261</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescently-labeled secondary antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageXpressMicro automated microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MetaXpress image analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rnai screening for host factors involved in vaccinia virus infection using drosophila cells

Pathogènes viraux représentent une menace de santé publique important, non seulement peut provoquer des épidémies des virus naturels de la maladie humaine, mais leur utilisation potentielle dans le bioterrorisme est aussi une préoccupation. Une meilleure compréhension des facteurs cellulaires que l&#39;infection impact serait de faciliter le développement de thérapies bien nécessaire. Les progrès récents dans l&#39;interférence ARN (ARNi) couplée à la technologie du génome séquençage complet de plusieurs organismes a conduit à l&#39;optimisation de l&#39;ensemble du génome, basé sur des cellules de perte de fonction des écrans. Cellules de drosophile sont particulièrement favorables à l&#39;échelle du génome écrans en raison de la la facilité et l&#39;efficacité de l&#39;ARNi dans ce système 1. Surtout, une grande variété de virus peuvent infecter les cellules de drosophile, y compris un certain nombre de virus de mammifères d&#39;importance médicale et agricole 2,3,4. Précédente écrans ARNi chez la drosophile ont identifié des facteurs d&#39;hôte qui sont nécessaires pour les différentes étapes de l&#39;infection du virus y compris l&#39;entrée, la traduction et de réplication de l&#39;ARN 5. Par ailleurs, bon nombre des facteurs cellulaires nécessaires à la réplication virale en culture cellulaire chez la drosophile sont également de limiter dans les cellules humaines infectées par ces virus 4,6,7,8, 9. Par conséquent, l&#39;identification des facteurs de l&#39;hôte co-opté au cours infection virale présente de nouvelles cibles pour des traitements antiviraux. Nous présentons ici un protocole généralisé pour un écran haut débit ARNi pour identifier les facteurs cellulaires impliqués dans l&#39;infection virale, à l&#39;aide virus de la vaccine comme un exemple.

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RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Facteurs de l&#39;hôte roman impliqués dans l&#39;infection virale peuvent être identifiés par la cellule basée échelle du génome perte de fonction ARNi dépistage. Une<em&gt; Drosophile</em&gt; Modèle de culture cellulaire est prête particulièrement bien à cette approche en raison de la facilité et l&#39;efficacité de l&#39;ARNi. Ici nous montrer cette technique en utilisant<em&gt; Vaccine</em&gt; Virus comme un exemple.

Dépistage ARNi pour les facteurs de l&#39;hôte impliqués dans Vaccine</emVirus Infection> aide Drosophile Cellules

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

rnai-screening-for-host-factors-involved-vaccinia-virus-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

9.4K vues.  University of Pennsylvania. Facteurs de l'hôte roman impliqués dans l'infection virale peuvent être identifiés par la cellule basée échelle du génome perte de fonction ARNi dépistage. Une Drosophile Modèle de culture cellulaire est prête particulièrement bien à cette approche en raison de la facilité et l'efficacité de l'ARNi. Ici nous montrer cette technique en utilisant Vaccine Virus comme un exemple.

Vidéo: RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

Dissection hôte-virus interaction dans la réplication lytique d&#39;un virus de l&#39;herpès modèle

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

Recherche

Immunologie et infection

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening for Identification of Genes Involved in Nonhost Resistance

Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important for developing durable disease-resistant plants against wide range of pathogens. Virus-induced gene silencing (VIGS)-based forward genetics screening is a useful approach for identification of plant defense genes imparting nonhost resistance. Tobacco rattle virus (TRV)-based VIGS vector is the most efficient VIGS vector to date and has been efficiently used to silence endogenous target genes in Nicotiana benthamiana.

	In this manuscript, we demonstrate a forward genetics screening approach for silencing of individual clones from a cDNA library in N. benthamiana and assessing the response of gene silenced plants for compromised nonhost resistance against nonhost pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato T1, P. syringae pv. glycinea, and X. campestris pv. vesicatoria. These bacterial pathogens are engineered to express GFPuv protein and their green fluorescing colonies can be seen by naked eye under UV light in the nonhost pathogen inoculated plants if the silenced target gene is involved in imparting nonhost resistance. This facilitates reliable and faster identification of gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. Further, promising candidate gene information can be known by sequencing the plant gene insert in TRV vector. Here we demonstrate the high throughput capability of VIGS-mediated forward genetics to identify genes involved in nonhost resistance. Approximately, 100 cDNAs can be individually silenced in about two to three weeks and their relevance in nonhost resistance against several nonhost bacterial pathogens can be studied in a week thereafter. In this manuscript, we enumerate the detailed steps involved in this screening. VIGS-mediated forward genetics screening approach can be extended not only to identifying genes involved in nonhost resistance but also to studying genes imparting several biotic and abiotic stress tolerances in various plant species.

Virus-induced gene silencing is an useful tool for identifying genes involved in nonhost resistance of plants. We demonstrate the use of bacterial pathogens expressing GFPuv in identifying gene silenced plants susceptible to nonhost pathogens. This approach is easy, fast and facilitates large scale screening and similar protocol can be applied to studying various other plant-microbe interactions.

VIGS-Mediated dépistage génétique avant pour l&#39;identification des gènes impliqués dans la résistance non hôte


	Nonhost disease resistance of plants against bacterial pathogens is controlled by complex defense pathways. Understanding this mechanism is important ...

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

Méthodologie pour la génération efficace de protéines du virus de la vaccine marquées par fluorescence

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of inflammation. They are key players in the innate immune system and play major roles in cancer biology. Neutrophils have been proposed as key mediators of malignant transformation, tumor progression, angiogenesis and in the modulation of the antitumor immunity; through their release of soluble factors or their interaction with tumor cells. To characterize the specific functions of neutrophils, a fast and reliable method is coveted for in vitro isolation of neutrophils from human blood. Here, a density gradient separation method is demonstrated to isolate neutrophils as well as mononuclear cells from the blood. The procedure consists of layering the density gradient solution such as Ficoll carefully above the diluted blood obtained from patients diagnosed with chronic lymphocytic leukemia (CLL), followed by centrifugation, isolation of mononuclear layer, separation of neutrophils from RBCsby dextran then lysis of residual erythrocytes. This method has been shown to isolate neutrophils &#8805; 90 % pure. To mimic the tumor microenvironment, 3-dimensional (3D) experiments were performed using basement membrane matrix such as Matrigel. Given the short half-life of neutrophils in vitro, 3D experiments with fresh human neutrophils cannot be performed. For this reason promyelocytic HL60 cells are differentiated along the granulocytic pathway using the differentiation inducers dimethyl sulfoxide (DMSO) and retinoic acid (RA). The aim of our experiments is to study the role of neutrophils on the sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents. However these methods can be generalized to study the interactions of neutrophils or neutrophil-like cells with a large range of cell types in different situations.

Neutrophils are the most abundant type of white blood cells. The isolation of neutrophils from human blood by density gradient separation method and the differentiation of human promyelocytic (HL60) cells along the granulocytic pathway are described here; to test their role on sensitivity of lymphoma cells to anti-lymphoma agents.

Neutrophiles Isolement et analyse pour déterminer leur rôle dans le lymphome cellulaire Sensibilité aux agents thérapeutiques

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

Les analyses microscopiques de Criblage à haut débit des facteurs de l&#39;hôte impliqués dans<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infection des cellules HeLa

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Dépistage des essais pour caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales impliqués dans la réponse inflammatoire

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus Infections comme outils de dépistage pour l’Identification des virales facteurs antiviraux immunomodulateurs et hôte

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

Imagerie cellulaire Interaction dans la muqueuse trachéale au cours de l’infection par le Virus grippal à l’aide de la microscopie intravitale biphotonique

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our knowledge of prevention and treatment of viral infection. The fruit fly Drosophila melanogaster has proven to be one of the most efficient and productive model organisms to screen for antiviral factors and investigate virus-host interaction, due to powerful genetic tools and highly conserved innate immune signaling pathways. The procedure described here demonstrates a nano-injection method to establish viral infection and induce systemic antiviral responses in adult flies. The precise control of the viral injection dose in this method enables high experimental reproducibility. Protocols described in this study include the preparation of flies and the virus, the injection method, survival rate analysis, the virus load measurement, and an antiviral pathway assessment. The influence effects of viral infection by the flies' background were mentioned here. This infection method is easy to perform and quantitatively repeatable; it can be applied to screen for host/viral factors involved in virus-host interaction and to dissect the crosstalk between innate immune signaling and other biological pathways in response to viral infection.

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

This protocol describes how to establish viral infection in vivo in Drosophila melanogaster using the nano-injection method and basic techniques to analyze virus-host interaction.

Mise en place d’une Infection virale et analyse de l’Interaction hôte-Virus chez Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Dépistage ARNi pour les facteurs de l'hôte impliqués dans Vaccine aide Drosophile Cellules