Les auteurs sont très reconnaissants à Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), qui a agi en tant que narrateur, ainsi que Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) et Megan Morgan (Département de la santé, ORS, OD, NIH) pour leur aide à faire le film qui accompagne ce manuscrit. En outre, nous tenons à remercier Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) pour la lecture critique du manuscrit. Cette recherche a été financée par le Programme de recherche intra-muros des NIH, le NIAID.

1 Fractionnement des cellules productrices de production initiale de trVLPs <ol><li> Retirez milieu à partir de 80-90% de confluence 293 cellules cultivées en flacons de 75 cm2 à moyen-élevé de glucose de Dulbecco modifié Eagle (DMEM) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de L-glutamine, et 1x stylo / angine (DMEM10 ). Laver les cellules deux fois avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), en faisant attention de ne pas déloger les cellules, et ajouter 2 ml de trypsine-EDTA pour les cellules. </li><li> Incuber les cellules à température ambiante jusqu&#39;à ce que les cellules montrent un arrondissement important quand on l&#39;observe sous un microscope (environ 30 secondes). Déloger les cellules en tapant ballon, et ajouter 8 ml DMEM10. Remettre en suspension les cellules à fond par un léger pipetage de haut en bas jusqu&#39;à une suspension cellulaire unique est observé lorsqu&#39;on les observe au microscope. </li><li> Compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé. Diluer les cellules de 2 x 10 5 cellules par ml dans DMEM10. Introduire à la pipette 2 ml de suspension cellulaire par puits dans des plaques 6 puits (4 x 105 cellules par puits). </li><li> Incuber les plaques dans un incubateur humidifié de culture de tissu à 37 ° C avec 5% de CO 2. </li></ol> 2. transfection des cellules de producteurs pour la production initiale de trVLPs <ol><li> 24 heures après le fractionnement des cellules (voir figure 5 pour un aperçu du calendrier de l&#39;expérience), l&#39;ADN plasmidique pipette 15 (pour des montants voir le tableau 1) dans un stérile de 2 ml cryovial l&#39;aide des conseils filtrés. Ajouter 100 ul OptiMEM par puits à l&#39;ADN. Vortex le mélange brièvement et doucement centrifuger les tubes à l&#39;aide d&#39;une micro-centrifugeuse. Si plusieurs puits doivent être transfectées avec des plasmides identiques, un mélange maître à plusieurs puits peut être faite. </li><li> Vortex brièvement le flacon avec Transit LT1 avant utilisation. Ajouter 7,5 ul Transit LT1 par puits à l&#39;ADN dilué. Vortex doucement le mélange en prenant soin de ne pas recueillir le liquide dans le couvercle de la cryovial, et incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Mélanger délicatement la transfectioncomplexe par pipetage de haut en bas. Ajouter 100 ul de complexes de transfection goutte à goutte dans chaque puits. Basculez la plaque avant / arrière et de gauche à droite afin de répartir les complexes de transfection. Ne pas agiter la plaque car cela provoquerait inégale diffusion des complexes de transfection. </li><li> Remettre les cellules dans l&#39;incubateur. </li><li> Après 24 heures, retirer le surnageant de cellules. Ajouter 4 ml de DMEM avec 5% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1 x pen / strep (DMEM5) aux cellules. Cette étape peut être effectuée pendant un maximum de 3 puits à la fois sans séchage des puits, en supposant que les puits contiennent des échantillons identiques (sinon, en raison de la nature d&#39;auto-amplification des trVLPs dans ce système, la contamination croisée peut devenir un problème, et Cette étape doit être effectuée une bien à la fois). </li><li> Remettre les cellules dans l&#39;incubateur. </li></ol> 3 Préparation des cellules cibles <ol><li> Divisez 293 cellules comme décrit dans la section 1, l&#39;ensemencement 4 x 10 5 cellules dans 2 ml DMEM10 par puits d&#39;unePlaque de 6 puits. </li><li> 24 heures après la séparation des cellules cibles et 24 heures avant l&#39;infection, les cellules cibles de transfection comme décrit dans la section 2 en utilisant l&#39;ADN des montants dans le tableau 1, et 4,5 ul Transit LT1 par puits. </li></ol> 4. infection des cellules cibles et la récolte de cellules productrices <ol><li> Transférer les surnageants des cellules productrices de tubes de 15 ml. Retirez et jetez tout surnageant restant en utilisant un tuyau d&#39;aspiration. Ajouter 250 ul de tampon de lyse pour les cellules Glo. </li><li> Centrifuger le surnageant pendant 5 min à 800 x g et à température ambiante pour effacer les échantillons de débris cellulaires. </li><li> Eliminer le surnageant d&#39;un puits de cellules cibles. Ajouter avec précaution 3 ml de surnageant de cellules autorisé, la production de cellules cibles à l&#39;aide de la pipette de la vitesse la plus lente. Éviter pipetage directement sur les cellules afin d&#39;éviter de perturber la monocouche cellulaire. Cette étape doit être effectuée une à la fois et. </li><li> Lorsque tous les échantillons ont été transpréféré, le rendement des cellules cibles de l&#39;incubateur pour permettre la sédimentation de trVLPs et l&#39;infection des cellules cibles. </li><li> Après 15 min d&#39;incubation à température ambiante dans le tampon de lyse Glo, remettre en suspension les cellules productrices dans le tampon de lyse à l&#39;aide d&#39;une micropipette réglée sur 150 pi, et transférer l&#39;échantillon dans un tube cryogénique 2 ml. À ce stade, les lysats peuvent être congelés à -80 ° C, ou directement mesurées comme décrit dans la section 6. </li><li> 24 h après l&#39;infection, retirer le surnageant des cellules cibles. Ajouter 4 ml DMEM5 par puits pour les cellules. Cette étape peut se faire jusqu&#39;à trois puits à la fois, si les puits contiennent des échantillons identiques (sinon, en raison de la nature de l&#39;auto-amplification des trVLPs dans ce système, la contamination croisée peut devenir un problème, et cette étape devrait être fait un bien à un moment). </li></ol> 5. récolte de cellules cibles pour un cycle infection unique <ol><li> Si seulement un seul cycle infectieux doit être évalué, à 72 heures après l&#39;infection supprimer til surnageant des cellules cibles en utilisant un tuyau d&#39;aspiration. </li><li> Récolter les cellules dans 250 pi de tampon de lyse Glo comme décrit dans la section 4 pour les cellules productrices. </li></ol> 6. récolte de cellules cibles et passages continus de trVLPs <ol><li> Si trVLPs doivent être en permanence à des passages, préparer une nouvelle série de cellules cibles, comme décrit dans l&#39;article 3 de sorte qu&#39;ils sont prêts pour l&#39;infection 72 heures après l&#39;infection de la première série de cellules cibles (voir figure 5). </li><li> Infecter le nouvel ensemble de cellules cibles comme décrit dans la section 4 (en utilisant le premier ensemble de cellules cibles à la place des cellules productrices). </li><li> Répétez ces étapes chaque 72 heures. </li></ol> 7 Analyse de Reporter activité <ol><li> Si les lysats de cellules ont été congelées, les décongeler à température ambiante. Veiller à ce que les échantillons ont atteint la température ambiante avant la mesure. </li><li> Décongeler la quantité requise (40 ul par échantillon) de tampon d&#39;essai de Renilla Glo (i idéalement congelésn aliquotes) à température ambiante. Assurez-vous que le tampon ait atteint la température ambiante avant la mesure. </li><li> Ajouter 1/100 ème volume de substrat de Renilla Glo au tampon d&#39;essai pour obtenir Renilla Glo Glo réactif Renilla, et mélanger au vortex. Introduire à la pipette 40 ul de réactif de Renilla Glo dans une plaque à 96 puits blanche. </li><li> Ajouter 40 ul d&#39;échantillon au réactif Renilla-Glo. Attendez 10 minutes, puis de mesurer les échantillons dans un luminomètre en utilisant un temps d&#39;intégration de 1 sec. </li></ol>

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Le test de trVLP tetracistronic décrit dans ce manuscrit permet de modéliser le cycle de vie du virus Ebola sur plusieurs cycles infectieux. Surtout, les trVLPs produites dans ce système ne contiennent pas l&#39;information génétique pour les protéines de la nucléocapside NP, VP35, VP30, et L, qui, ensemble, constituent près de 60% du génome du virus Ebola et qui sont essentielles à la réplication virale. Au contraire, ces protéines doivent être fournis dans les cellules cibles en trans à partir de plasmides d&#39;expression, et une infection de cellules n&#39;exprimant pas tous quatre de ces protéines est avortée. Surtout, il n&#39;existe aucune preuve de recombinaison génétique pour les filovirus, et il n&#39;y a pas de régions homologues partagées entre le minigénome tetracistronic et les plasmides d&#39;expression pour les protéines de la nucléocapside. Par conséquent, il n&#39;est ni pratique, ni aucune preuve de tout fondement théorique qui pourrait prévoir la possibilité de générer des virus Ebola pleine longueur génomes qui pourraient alors entraîner potentiellementla production de virus infectieux Ebola, ce qui rend ce système sûr pour une utilisation dans des conditions BSL2. Il existe deux étapes critiques de l&#39;essai de trVLP tetracistronic qui sont influencées par des conditions expérimentales, à savoir la production de trVLPs, et l&#39;infection de cellules cibles avec ces trVLPs. Production de trVLPs dépend des niveaux élevés de replication et la transcription minigénome, qui à son tour dépend de l&#39;efficacité de transfection élevée. L&#39;efficacité de transfection peut être facilement évaluée par un contrôle dont -L, dans laquelle le plasmide d&#39;expression L est échangé contre un plasmide d&#39;expression codant pour eGFP. taux de transfection dans ces conditions devraient dépasser 50% par l&#39;inspection avec un microscope à fluorescence 24 heures après transfection. En outre, les cellules doivent être exemptes de mycoplasmes, puisque dans notre contamination par des mycoplasmes expérience altère considérablement la réplication et la transcription minigénome (données non publiées). Grâce à leur haute transfectabilité 293 CElls sont la lignée cellulaire de choix pour des essais de trVLP; cependant, ces cellules sont relativement peu sensibles (quoique pas complètement de réfraction) de l&#39;infection par le virus Ebola 16. Expression d&#39;un facteur d&#39;attachement tels que Tim-1 améliore l&#39;infection de cellules 293 avec trVLPs environ 100 fois, et est crucial pour le succès de ce système sur plusieurs passages. Alors que trVLPs tetracistronic ne sont pas auto-réplication sur leur propre, ils sont auto-réplication dans les cellules qui expriment les protéines de la nucléocapside. En tant que tel, des précautions doivent être prises pour éviter la contamination croisée entre les puits contenant différentes trVLPs (par exemple, avec différentes mutations dans le minigénome). Du point de vue technique plus, en raison de la grande différence entre les signaux positifs et négatifs dans cet essai (environ 4 log), la diaphonie entre les échantillons lors de la mesure de l&#39;activité de luciférase peut être un problème; cependant, ceci peut être facilement évité en laissant ainsi un vide entre chaque échantillon dans l&#39;Plaque de 96 puits utilisée pour mesurer l&#39;activité luciférase. Il ya une multitude d&#39;applications possibles pour trVLPs tetracistronic. De toute évidence, ils sont bien adaptés à l&#39;étude de l&#39;entrée de particules de filovirus, depuis trVLPs infectieuses ont la structure typique en forme de fil de filovirus infectieuses 14, et contiennent les mêmes composants viraux que des particules de filovirus. Surtout, ils ne contiennent pas de composants d&#39;autres virus, comme c&#39;est le cas pour l&#39;utilisation de virions pseudotypés ou de particules analogues à des virus, telles que des particules de type retrovirus portant GP 1,2, ou de virus recombinants, tels que le virus de la stomatite vésiculeuse recombinant exprimant GP 1,2 . L&#39;obligation pour les facteurs de fixation lors de l&#39;utilisation des cellules 293 en tant que cellules cibles dans ce système peut être exploité pour dépister et étudier le rôle de ces facteurs d&#39;attachement, tandis que le rôle des autres facteurs cellulaires, tels que ceux impliqués dans la réplication du génome et de la transcription, ainsi que morphogenèse et bourgeonding, peut être étudiée en utilisant la technologie ARNi. L&#39;effet de mutations dans les protéines virales sur le cycle de vie du virus peut également être étudié, mais il faut garder à l&#39;esprit que, bien que VP40, GP 1,2, et VP24 sont exprimés après la transcription virale, l&#39;expression des autres protéines virales est réalisée à partir de l&#39;expression plasmides, de sorte que les effets dus à la surexpression de ces protéines doivent être prises en compte. En outre, il faut veiller à ce que des mutations dans le minigénome ne modifient pas de façon significative la durée de la minigénome, puisque l&#39;activité de journaliste est directement affectée par minigénome longueur 15. Enfin, depuis minigénomes tetracistronic sont analogues du génome viral qui portent des gènes viraux, et sont reproduits par le complexe de polymerase virale, il devrait également être possible d&#39;étudier l&#39;évolution de ces gènes en réponse à des mutations dans des conditions de BSL2. Ainsi, alors que d&#39;autres études sont encore nécessaires dans cette direction, il doit être possible, par exemple, à introduire sous-optimalemutations dans les gènes dans les minigénome puis trVLPs de passage jusqu&#39;à ce que des mutations gratuits émergent. L&#39;une des limites du test de trVLP tetracistronic qui doit être gardé à l&#39;esprit le fait que, s&#39;il modèles plus du cycle de vie du virus, de la transcription primaire de cellules cibles n&#39;est pas modélisé par ce système, puisque les cellules cibles doivent exprimer les protéines de la nucléocapside de trans pour que les trVLPs à répliquer. Si la transcription primaire doit être évalué, il est possible d&#39;utiliser des cellules cibles naïves 10; Toutefois, dans ce cas, aucune réplication du génome a lieu dans les cellules cibles, et aucun autre trVLPs infectieuses sont produites, avorter l&#39;infection. C&#39;est un problème capital qui ne peut être surmontée sans rendre les trVLPs complètement auto-réplication, y compris par les gènes pour les protéines de la nucléocapside dans le minigénome, ce qui de facto les transformer en virus Ebola recombinants infectieux. En fait, Ebolun virus exprimant la luciférase ou d&#39;autres journalistes ont été générées et peuvent être utilisés pour évaluer et étudier la réplication du génome et la transcription 17,18; cependant, leur utilisation est restreinte à des laboratoires de BSL4. En outre, il doit être gardé à l&#39;esprit que, bien que VP40, GP 1,2, et VP24 sont exprimés à partir d&#39;un analogue du génome viral, leur position dans la minigénome (2 ème, 3 ème et 4 ème unité de transcription) n&#39;est pas identique à leur position dans le génome viral (3 ème, 4 ème et 6 ème unité de transcription), ce qui pourrait influencer leur taux d&#39;expression absolu, ainsi que leurs niveaux d&#39;expression relatifs par rapport à l&#39;autre. Dans l&#39;ensemble, l&#39;analyse de trVLP tetracistronic représente le système de modélisation du cycle de vie le plus complet pour les virus Ebola disponibles à ce jour, et permet la modélisation de la réplication du génome et la transcription, la morphogenèse des particules et en herbe, ainsi que l&#39;attachement et enessayer dans les cellules cibles sur plusieurs cycles infectieux. En tant que tel, il a un énorme potentiel pour une utilisation dans les enquêtes sur la biologie du virus Ebola dans des conditions BSL2.

Virus Ebola sont l&#39;agent causal de la fièvre hémorragique sévère chez l&#39;homme et les primates non-humains avec des taux allant jusqu&#39;à 90% de létalité des épidémies humaines 1. Bien qu&#39;il y ait eu des progrès significatifs au cours des dernières années dans le développement de vaccins ainsi que des traitements spécifiques (revue dans 2,3), ceux-ci ne sont pas approuvés pour la consommation humaine. Des particules de virus Ebola ont un aspect en forme de fil ayant une longueur typique d&#39;environ 1 pm et un diamètre de 96 à 98 nm 4. Il se forme de la nucléocapside du fondamentales des particules virales et se compose de 1) la non-segmenté génome à ARN négatif de simple brin, qui code les gènes 7 de virus Ebola (Figure 1), 2) la nucléoprotéine NP, qui encapside le génome, 3 ) le complexe de polymerase virale constitué par la polymérase L et son cofacteur de VP35, et 4) l&#39;activateur transcriptionnel VP30. En outre, il a été montré récemment que la protéine VP24 de est également associée à la nucléocapsides 4. La nucléocapside est entourée par l&#39;espace de matrice, dans lequel la protéine VP40 de matrice, qui est responsable de la morphogenèse et le bourgeonnement de virions, est situé. Les particules virales sont ensuite enveloppés, et incorporés dans cette enveloppe est la seule protéine de surface de 1,2 GP, qui est responsable de l&#39;attachement des virions et l&#39;entrée. Travailler avec des virus infectieux Ebola doit être effectué dans un laboratoire de confinement à haute sécurité sous le niveau de biosécurité (BSL) 4 conditions, ce qui limite ce travail à quelques installations dans le monde. Afin d&#39;étudier la biologie de ces virus ou de développer de nouvelles thérapies dans des conditions BSL2, les chercheurs s&#39;appuient soit sur la surexpression recombinante de protéines du virus Ebola, ou sur des systèmes de modélisation du cycle de vie, qui peuvent tous deux être travaillé avec l&#39;absence de virus infectieux Ebola. L&#39;expression recombinante de protéines du virus Ebola est soit réalisée à partir des plasmides d&#39;expression ou des vecteurs viraux. Un cas particulier de cette stratégie est laproduction de virions ou des particules de type viral basé sur les virus autres que le virus Ebola (rétrovirus ou le plus souvent le virus de la stomatite vésiculaire), en présence de 1,2 GP exprimée par recombinaison, conduisant à la génération de particules de pseudotypés, qui peut être utilisé pour étudier l&#39; processus d&#39;entrée des filovirus et écran pour les inhibiteurs d&#39;entrée 5. Alternativement, les virus recombinants (par exemple, le virus de la stomatite vésiculaire) qui codent pour le virus Ebola GP 1,2 au lieu de leur propre glycoprotéine peuvent être générés et utilisés pour étudier l&#39;entrée du virus sous le niveau de biosécurité 2 conditions 6. Les systèmes de modélisation du cycle de vie sont des formes de systèmes de génétique inverse comportant l&#39;utilisation d&#39;analogues tronqués du génome du virus Ebola (les minigénomes), qui sont initialement produites à partir d&#39;ADNc et ensuite répliqués et transcrits par les protéines du virus Ebola fournies en trans. Le premier système de minigénome pour le virus Ebola a été développé il ya plus de 15 ans 7, Et a depuis été utilisée pour étudier la replication du génome du virus Ebola et la transcription (revue dans 8,9). Dans ce système, un minigénome monocistronique constitué par un gène rapporteur unique flanquée des régions terminales non codantes du génome du virus Ebola (appelée la tête et de queue) (Figure 1) est exprimé dans des cellules de mammifères (en général par transcription utilisant l&#39;ARN polymerase de T7) avec les protéines virales L, VP35, VP30 et NP. Le minigénome est encapsidé par NP, et ensuite répliqué et transcrit par les autres protéines de la nucléocapside à l&#39;aide de signaux agissant en cis localisées dans la tête et de queue, ce qui conduit à une activité de journaliste qui reflète ces deux aspects du cycle de vie du virus (figure 2). Afin de modéliser des étapes supplémentaires du cycle de vie viral, la transcription et la réplication compétente particules de type viral (trVLP) systèmes ont été développés, qui sont fondées sur les systèmes de minigénome classiques, mais en vedette la uneexpression supplémen taires des autres protéines virales VP24, VP40 et GP 1,2 à partir de plasmides d&#39;expression 10,11. La présence de VP40 conduit à la formation de trVLPs, 1,2 GP qui portent sur ​​leur surface, et effectuer une nucléocapside contenant minigénome-à l&#39;intérieur. Ces trVLPs peuvent être utilisés pour infecter des cellules cibles, qui ont été soit pretransfected avec des plasmides d&#39;expression pour L, VP35, VP30 et NP, pour faciliter la replication et la transcription de minigénomes introduits dans les cellules cibles à l&#39;intérieur de trVLPs 11, ou des cellules cibles naïves (c&#39;est sans expression induite par le plasmide de protéines du virus Ebola) 10. Il en résulte une activité de rapporteur dans des cellules cibles, ce qui reflète la réplication des minigénomes dans les cellules productrices, la morphogénèse et le bourgeonnement de trVLPs, leur entrée dans les cellules cibles, et 1) dans le cas de cellules cibles pretransfected génome également la réplication et la transcription secondaire ( c&#39;est à dire des protéines par transcription virale produced dans les cellules cibles) dans des cellules cibles, ou 2) dans le cas de cellules cibles naïves également transcription primaire (c&#39;est à dire la transcription par les protéines virales introduites dans des cellules cibles à l&#39;intérieur de trVLPs) (figure 3). Surtout, ces systèmes n&#39;ont été utilisés pour modéliser un cycle infectieux unique, et de compter sur la surexpression de toutes les protéines virales, qui dans le cas de VP24 et VP40 est particulièrement problématique, car il a été démontré ces protéines d&#39;être solides régulateurs négatifs de la réplication du génome et transcription lorsqu&#39;elle est surexprimée à partir de plasmides 12,13. En outre, les préparations trVLP produites dans ces systèmes contiennent une forte proportion de particules non infectieuses, qui pose des problèmes pour l&#39;analyse biochimique de trVLPs infectieuses 14. Afin de surmonter ces problèmes, nous avons récemment développé un système de minigénome tetracistronic que, en plus d&#39;un gène rapporteur, contient également les gènes codant pour VP40, GP 1,2 etVP24 (figure 1). Comme pour le système de minigénome monocistronique classique, ce système conduit à la production de trVLPs qui peuvent infecter des cellules cibles (figure 4) 15. Cependant, contrairement au système de minigénome classique, VP40, 1,2 GP, et VP24 sont produites après la transcription du génome viral plutôt que d&#39;être surexprimé à partir de plasmides. Par conséquent, la cinétique et les niveaux d&#39;expression de ces protéines imitent beaucoup plus proches de celles trouvées lors du cycle de vie viral, et par conséquent le rapport des infectieuse à trVLPs non infectieux est augmenté d&#39;environ 500 fois dans 15 ce système. En outre, l&#39;utilisation de ce système, il a été possible de passage en continu des trVLPs contenant de minigénome-tetracistronic, la modélisation des cycles multiples infectieuses. En tant que tel, trVLPs tetracistronic sont actuellement le système de modélisation du cycle de vie le plus complet disponible pour étudier la biologie à virus Ebola dans des conditions BSL2. Ici, nous fournissons des informations détaillées sur l&#39;utilisation of ce système, ainsi que sur les résultats attendus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

Virus Ebola causent de graves fièvres hémorragiques chez les humains et les primates non humains, avec des taux de létalité plus élevé que 90%. Il n&#39;existe aucun vaccin approuvé ou des traitements spécifiques pour la maladie causée par ces virus, et de travailler avec des virus infectieux Ebola est limitée à niveau de biosécurité 4 laboratoires, ce qui limite considérablement la recherche sur ces virus. systèmes de modélisation du cycle de vie du modèle du cycle de vie du virus sous le niveau de biosécurité 2 conditions; Cependant, jusqu&#39;à récemment, de tels systèmes ont été limitées soit à des aspects particuliers du cycle de vie du virus, ou un seul cycle infectieux. Minigénomes Tetracistronic, qui comprennent les régions de virus Ebola non codantes, un gène rapporteur, et trois gènes du virus Ebola impliqués dans la morphogenèse, le bourgeonnement et l&#39;entrée (VP40, GP 1,2, et VP24), peuvent être utilisés pour produire la réplication et de la transcription particules -competent pseudo-virales (trVLPs) contenant ces minigénomes. Ces trVLPs peuvent continuellement infecter les cellules exprimant le virus Ebolaprotéines responsables de la réplication du génome et la transcription, ce qui nous permet de modéliser en toute sécurité plusieurs cycles infectieux sous le niveau de biosécurité 2 conditions virus. Fait important, les composants viraux de ces systèmes sont exclusivement dérivées de virus Ebola et pas d&#39;autres virus (comme c&#39;est par exemple le cas dans les systèmes utilisant des virus pseudotypés), et VP40, VP24 et 1,2 GP ne sont pas surexprimé dans ce système Il est donc idéalement adapté pour l&#39;étude de la morphogenèse, le bourgeonnement et l&#39;entrée, bien que d&#39;autres aspects du cycle de vie du virus telles que la réplication du génome et la transcription peuvent également être modélisés avec ce système. Par conséquent, le dosage de trVLP tetracistronic représente le système de modélisation du cycle de vie le plus complet disponible pour les virus Ebola, et dispose d&#39;un énorme potentiel pour une utilisation dans les enquêtes sur la biologie du virus Ebola dans le futur. Ici, nous fournissons des informations détaillées sur l&#39;utilisation de ce système, ainsi que sur les résultats attendus.

La transfection de 293 cellules productrices avec les plasmides d&#39;expression codant pour le virus Ebola protéines de la nucléocapside NP, VP35, VP30, et L, un minigénome tetracistronic et les résultats de la polymérase accessoire T7 dans minigénome la réplication et de la transcription et l&#39;activité du rapporteur qui est facilement détectable à 72 h (Figure 6 ). Fait important, l&#39;activité du rapporteur observé (10 5,6 unités relatives de luminescence (RLU)) est supérieure à celle d&#39;un témoin négatif dans lequel le plasmide d&#39;expression codant pour L a été omis de la transfection (10 RLU 3) de plus de 2 logs. Le faible niveau de l&#39;activité observée même en l&#39;absence de L est probablement dû à un promoteur cryptique dans le plasmide minigénome. Les cellules cibles infectées par le trVLPs partir du surnageant de cellules productrices présentent en fait quelque peu augmenté les niveaux de l&#39;activité du rapporteur en comparaison à des cellules productrices, et peut atteindre des valeurs entre 10 6 et 10 7 RLU en fonction du passage. En revanche, avecorsque le surnageant de cellules productrices de contrôle -L est soumis à des passages sur des cellules cibles (exprimant toute protéine de nucléocapside, y compris L), l&#39;activité du rapporteur ne dépasse pas le bruit du luminomètre (environ 10 2 ULR) de fond. Le test de trVLP tetracistronic peut être utilisée pour étudier le cycle de vie des virus Ebola. Par exemple, l&#39;infection de cellules 293 avec trVLPs est dépendante de la présence de facteurs d&#39;attachement tels que Tim-1, 16, qui doivent être fournies en trans dans ces cellules. Par conséquent, dans un essai de trVLP tetracistronic une baisse de l&#39;activité du rapporteur dans les cellules cibles de l&#39;ordre de 100 fois est observée en l&#39;absence de Tim-1 (figure 7A). Le rôle des protéines spécifiques (virales ou cellulaires) dans le cycle de vie du virus peut également être évaluée en utilisant la technologie ARNi avec cette approche. A titre d&#39;exemple, l&#39;ARNi médiée par la régulation de L se traduit par une baisse de l&#39;activité de reporter d&#39;environ 100 fois, ce qui reflète le rôle central de L dansla réplication et de la transcription (Figure 7B) 7. En outre, il est possible de manipuler directement le minigénome d&#39;évaluer l&#39;effet de mutations sur le cycle de vie du virus. Par exemple, quand VP24-expression de la minigénome est aboli par l&#39;introduction de trois codons stop immédiatement en aval du codon d&#39;initiation, l&#39;activité du rapporteur dans les cellules de producteurs n&#39;est pas radicalement changé; Toutefois, l&#39;activité du rapporteur dans les cellules cibles est réduite d&#39;environ 20 fois au bout d&#39;un passage, et 400 fois après deux passages, ce qui indique un rôle de VP24 dans la production de trVLPs infectieux (figure 7C) 15. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1: Structure du génome du virus Ebola ainsi que minigénomes monocistroniques et tetracistronic. Régions de la protéine du virus Ebola de codage sont indiqués en rouge (NP,VP35, VP30, et L), jaune (VP40 et VP24) ou bleu (GP) 1,2 boîtes. Régions non codantes (NCR) sont indiquées en vert, avec les régions de tête et de queue indiqués. L&#39;indice indique NCR virale qui a été utilisée pour joindre les régions codantes. La région codant pour le journaliste (rep) est représentée en violet. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2 monocistronique de dosage de minigénome. Cellules sont transfectées avec des plasmides d&#39;expression pour les protéines de la nucléocapside du virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigénome monocistronique (mg) et de la polymerase de T7. Le minigénome est d&#39;abord transcrit par la polymérase de T7 (a) dans un ARN minigénome unencapsidated dans la même orientation que le génome viral (ARNv), qui est ensuite encapsidé par NP (b). Cette encapsidé ARNv est répliqué par un ARN minigénome complémentaire (ARNc) intermédiaire (c), puis transcrit en ARNm rapporteurs (d) qui sont traduits en protéine rapporteur (e). <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3 trVLP essai avec un minigénome monocistronique. Cellules sont transfectées avec des plasmides d&#39;expression pour les composants de dosage de minigénome (les Ebola nucléocapside du virus de protéines NP, VP35, VP30, L, un minigénome monocistronique et la polymerase de T7) ainsi que VP40, GP 1 , 2 et VP24. Cela conduit à la formation de trVLPs qui incorporent nucléocapsides contenant minigénome-(f). Ces trVLPs peuvent ensuite infecter des cellules cibles (g), qui sont soit pretransfected avec des plasmides d&#39;expression de NP, VP35, VP30, et L (en haut), ce qui entraîne la réplication et la transcription secondaire (d) conduisant à l&#39;expression du rapporteur (e), ou naïf les cellules cibles (en bas), ce qui entraîne la transcription de la première minigenomes (h), ce qui conduit également à l&#39;expression d&#39;auteur (e). <img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> Figure 4 trVLP essai avec un minigénome tetracistronic. Cellules sont transfectées avec des plasmides d&#39;expression pour les protéines de la nucléocapside du virus Ebola (NP, VP35, VP30, L), un minigénome tetracistronic (mg) et de la polymerase de T7. Transcription initiale (a), l&#39;encapsidation (b), la replication du génome (c) et de la transcription (d) ainsi que la traduction (e) se produisent comme dans un dosage de minigénome monocistronique. Cependant, en plus de l&#39;ARNm rapporteur, les ARNm pour VP40, VP24 et 1,2 GP sont également transcrit à partir du minigénome tetracistronic, conduisant à la formation de trVLPs (f). Ces trVLPs infecter les cellules cibles qui ont été pretransfected avec des plasmides d&#39;expression pour les protéines de la nucléocapside NP, VP35, VP30 et L, ainsi que le virus Ebola cellulairefacteur d&#39;attachement Tim-1, ce qui entraîne la réplication du génome, et la transcription et la production de trVLPs qui peuvent être utilisés pour infecter des cellules cibles frais. <img alt="Figure 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> Figure 5 Délai d&#39;un essai de trVLP tetracistronic pour 3 passages consécutifs. Les jours pour les cellules d&#39;ensemencement (s), la transfection de cellules (T), l&#39;infection des cellules (i), le changement moyen (c) et la récolte des cellules et trVLPs (h) sont indiqué pour trois passages consécutifs (indiqué par les flèches). <img alt="Figure 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> Figure 6: niveaux typiques de l&#39;activité du rapporteur observé dans un essai de trVLP tetracistronic. Un dosage de trVLP tetracistronic a été réalisée sur cinq passages suivant la protocol décrit dans ce manuscrit. Comme contrôle négatif, le plasmide d&#39;expression codant pour L a été omis (-L) à partir de la transfection de cellules productrices de p0. Les cellules cibles dans les passages P1 à P5 ont été transfectées avec des plasmides d&#39;expression pour les protéines de la nucléocapside, y compris L. Le bruit de fond de la luminomètre est indiqué par une ligne en pointillés. Des moyens et les écarts types de 4 répétitions biologiques à partir de 3 expériences indépendantes sont présentés. <img alt="Figure 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> Figure 7 Évaluation de l&#39;impact de divers facteurs viraux et cellulaires sur le cycle de vie viral en utilisant trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 en tant que facteur d&#39;attachement. Cellules cibles qui ont été pretransfected avec des plasmides d&#39;expression codant pour les protéines de la nucléocapside et avec ou sans un plasmide codant pour Tim-1 (décrit dans 15) ont été infectées avec tettrVLPs racistronic. Après l&#39;infection l&#39;activité du rapporteur de 72 heures dans des cellules cibles a été déterminée p1. Moyennes et écarts types de 4 répétitions biologiques à partir de 4 expériences indépendantes sont présentés. (B) Effet de l&#39;ARNi knockdown de L sur la réplication du génome et de la transcription. Cellules cibles qui ont été pretransfected avec des plasmides d&#39;expression pour les composants de la nucléocapside, Tim-1 et miARN dirigés contre L (anti-L) ou une protéine non apparentée (anti-GFP) (décrit dans 15) ont été infectées par trVLPs tetracistronic. Après l&#39;infection l&#39;activité du rapporteur de 72 heures dans des cellules cibles a été déterminée p1. Moyens et les écarts-types de 5 répétitions biologiques à partir de 2 expériences indépendantes sont présentés. (C) Effet de mutations dans le minigénome sur trVLP infectieux. Un essai de trVLP tetracistronic a été réalisée en utilisant soit un minigénome de type sauvage (4cis-WT) ou un minigénome dans dont trois codons d&#39;arrêt ont été introduites immédiatement après le codon d&#39;initiation de VP24, la suppression de l&#39;expression of cette protéine mais en introduisant des changements minimes au minigénome en ce qui concerne la longueur, la composition de l&#39;acide nucléique, des structures secondaires, etc activité de journaliste dans P0, P1 et P2 a été mesurée 72 heures après transfection / infection. Moyens et écarts-types de 3 répétitions biologiques à partir de 3 expériences indépendantes sont présentés. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> Les cellules de producteurs (p0) </td><td style="width:180px;"> Les cellules cibles (p1 et plus) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td height = &quot;19&quot; style = &quot;height: 19px;&quot;&gt; pCAGGS-L </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-ARNv Rluc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-tim1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> Le tableau 1 représente l&#39;ADN pour la transfection. La quantité requise de chaque plasmide pour la transfection des cellules cibles et la production est représentée en ng par puits d&#39;une plaque à 6 puits. Tous les plasmides sont décrits dans 15 Watt et al.

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Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Travailler avec des virus infectieux Ebola est limitée à niveau de biosécurité 4 laboratoires. Tetracistronic réplication et de transcription virus compétent comme des particules contenant minigénome-(trVLPs) représentent un système de modélisation du cycle de vie qui nous permet de modéliser en toute sécurité plusieurs cycles infectieux sous le niveau de biosécurité 2 conditions, en s&#39;appuyant exclusivement sur Ebola composants du virus.

Modélisation du cycle de vie du virus Ebola Sous biosécurité de niveau 2 Conditions de particules de type viral contenant Tetracistronic minigénomes

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K vues.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Travailler avec des virus infectieux Ebola est limitée à niveau de biosécurité 4 laboratoires. Tetracistronic réplication et de transcription virus compétent comme des particules contenant minigénome-(trVLPs) représentent un système de modélisation du cycle de vie qui nous permet de modéliser en toute sécurité plusieurs cycles infectieux sous le niveau de biosécurité 2 conditions, en s'appuyant exclusivement sur Ebola composants du virus. 

Vidéo: Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Surveillance de l&#39;influenza aviaire aux ALE Cartes: méthodes de terrain, la biosécurité et les questions de transport Résolu

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

L&#39;analyse de l&#39;accessibilité au solvant des résidus de cystéine sur<em&gt; Cueilleur rayado fino virus</em&gt; Virus-like particles produits dans<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantes et réticulation des peptides à VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

Mesures de sécurité et procédures d&#39;exploitation dans un (A) 4-BSL laboratoire: Procédures 1. biosécurité de niveau 4 Suit Laboratoire Suite entrée et de sortie

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro et in vivo modèle pour étudier l&#39;adhésion bactérienne au navire muraux dans des conditions de débit

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-immunoprécipitation de la protéine souris Mx1 avec le virus Influenza A nucléoprotéine

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Analyse des Lymphocytes extravasation L&#39;utilisation d&#39;un<em&gt; In vitro</em&gt; Modèle de la barrière hématoencéphalique humaine

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Production de pseudo particules pour étudier les coronavirus hautement pathogènes dans un cadre de niveau 2 de Biosafety

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Application de perturbations de massage cohérentes sur les veaux de souris et surveillance des changements de pression intramusculaire qui en résultent

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Test ELISA in Vitro pour évaluer la puissance vaccinale contre la rage

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...