Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies infectieuses. En ce qui concerne la dengue, ou fièvre chikungunya. Principal avantage de cette technique elle-même, elle est capable de quantifier l’ARN viral d’une manière simple et rapide.
Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu d’une recherche fondamentale sur le virus, elle peut également être appliquée à d’autres recherches telles que l’étude de dépistage des médicaments à haute teneur en médicaments et le diagnostic clinique contre les virus populogènes humains. Une démonstration majeure de cette méthode est essentielle. Comme les timbres de traitement de l’échantillon et une armoire de biosécurité sont importants pour éviter la contamination croisée ou l’infection en laboratoire.
Démonstration de la procédure sera un professeur adjoint et notre assistant technique de notre laboratoire. Après avoir préparé le modèle d’ADN pour la norme d’ARN, mélanger la réaction de transcription in vivo avec 100 nanogrammes du modèle d’ADN préparé dans un tube PCR de 0,2 millilitre. Incuber à 37 degrés Celsius dans un cycleur thermo pendant deux heures.
Après cela, ajouter un microlitre de DNAase et poursuivre l’incubation à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Mettez en place un kit de purification de l’ARN et ajoutez 80 microlitres d’eau libre RNAase et 350 microlitres de tampon de capture, y compris 1% de bêtamarcaptoéthanol au mélange de réaction dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 250 microlitres de 100% d’éthanol et utiliser une pipette pour mélanger.
Ensuite, assemblez une colonne de purification de l’ARN avec un tube de collecte. Transférez l’échantillon d’ARN dans la colonne de purification. Centrifugez la colonne à 8000 fois G pendant 15 secondes et jetez le flux à travers.
Ensuite, appliquez 500 microlitres de tampon de lavage sur la colonne et centrifugeuse à 8000 fois G pendant deux minutes. Après cela, placez la colonne dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre. Ajouter 50 microlitres d’eau libre RNAase et incuber à température ambiante pendant une minute.
Centrifugez la colonne à vitesse maximale pendant une minute pour alluter l’ARN. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la densité optique de 3 microlitres de l’ARN alluté à 260 nanomètres. Ensuite, déterminez le numéro de copie du virus de la dengue synthétisé trois ARN UTR premier.
Conserver la norme d’ARN à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi. Tout d’abord, mélanger 199 microlitres de tampon de traitement avec un microlitre de proteinase sans nucléase K.En utilisant le milieu de culture cellulaire, diluer en série le virus de la dengue préparé trois ARN UTR premier un à dix pour obtenir des normes d’ARN à des concentrations allant de 5000,000 à 5000 exemplaires par microlitre en répétant pipetting et vortex. Transférer 5 microlitres du supernatant de culture des cellules infectées par le virus de la dengue et la norme d’ARN UTR de premier choix du virus dengue 3 aux bandes A2 PCR ou aux puits d’une plaque PCR de 96 puits.
Mélanger en cinq microlitres de la solution contenant le tampon de traitement et la proteinase K.Centrifugeuse brièvement à 200 fois G pendant cinq secondes. Incuber les échantillons dans un cycleur thermo à 25 degrés Celsius pendant dix minutes, puis à 75 degrés Celsius pendant cinq minutes. À l’aide du virus dengue, trois amorces spécifiques à l’UTR de premier plan et une sonde fluorogène préparent un mélange principal de PCR RTQ avec un reagent RT PCR d’une étape dans un tube de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Alloquote huit microlitres du maître se mélangent dans un puits d’une plaque PCR en temps réel 96. Ensuite, ajoutez deux microlitres de chaque échantillon à chaque puits de la plaque PCR en temps réel de 96. Sceller la plaque avec un film adhésif optiquement clair.
Centrifugez brièvement les plaques à 200 fois G pendant cinq secondes pour enlever les bulles d’air. Ensuite, placez la plaque dans un instrument PCR en temps réel. À l’aide d’un logiciel associé au PCR en temps réel, accédez à la fenêtre de mise en place et attribuez le puits d’une réaction à analyser sous forme d’échantillon inconnu.
Ensuite, attribuez le puits du virus de la dengue dilué en série trois ARN UTR premier comme norme et tapez le numéro de copie prévu de la norme d’ARN dans chaque puits. Attribuez le contrôle non-modèle comme le contrôle négatif. Ensuite, démarrez l’instrument RT PCR et faites le cycle de la plaque tel qu’il est décrit dans le protocole texte.
Dans la fenêtre d’analyse, cliquez sur analyser et assurez-vous que le coefficient de corrélation de la courbe standard générée est équivalent ou supérieur à 0,98. En général, utilisez les paramètres CT par défaut pour l’analyse. Dans cette étude, une dilution en série dix fois de l’ARN standard du virus de la dengue est soumise à une analyse directe rtq PCR à l’aide de trois amorces spécifiques utr premier et une sonde fluorogène.
La courbe linéaire de cette analyse montre que la corrélation est bonne. Ensuite, cet essai direct rtq PCR est appliqué pour quantifier le virus de la dengue dans la culture supernatant des cellules infectées par le virus. Une bonne corrélation est observée entre le litre d’infection par le virus de la dengue et le CT, un numéro de cycle qui est considéré comme le point où le signal fluorescent augmente avec une croissance exponentielle au-dessus de l’arrière-plan.
Lorsque les valeurs de CT générées par une dilution en série du stock du virus dengue avec des titres infectieux connus sont tracées sur la courbe standard précédemment générée, les données pour les échantillons allant de 08 à 8 000 PFU par réaction sont considérées comme se situent dans la fourchette de ceux soumis à l’ARN standard. Cela indique que les échantillons de virus de la dengue avec un large éventail de titres infectieux peuvent être analysés en même temps lors de l’utilisation de cette technique. Cet essai est en outre évalué pour son applicabilité à valider les agents antiviraux contre le virus de la dengue.
Lorsqu’il est traité avec 50 microgrammes par millilitre de MPA, une réduction d’environ 99,87% de la culture de contrôle traitée par DMSO est observée. Enfin, les applications de ce test avec d’autres virus ARN sont testées. Lorsqu’un stock de souche vaccinale Virus 17D du virus de la fièvre jaune est soumis à un RTQ PCR direct, une courbe standard est générée avec une bonne corrélation directe entre les titres du virus et les valeurs de CT.
De même, l’analyse directe du RTQ PCR du virus de la rougeole et du stock brut de souches du virus du chikungunya donne une bonne régression entre les titres infectieux et les valeurs de tomodensitaire. Cette technique ouvrira la voie aux chercheurs dans le domaine de l’étude de dépistage. Permettre à un grand nombre d’échantillons d’explorer de nouveaux médicaments antiviraux est simpliste.
N’oubliez pas que le travail avec des matériaux ré infectieux peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que l’utilisation d’équipement de protection individuelle et d’une armoire de biosécurité propre doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
