L’objectif global du protocole est d’isoler les cellules primaires des microglies des tissus cérébraux humains adultes vivants. Dans notre cas, ceci a été rassemblé comme fenêtre chirurgicale pendant la chirurgie. Ceci est accompli en recueillant d’abord les tissus cérébraux dans la glace froide PBS, le tissu est ensuite en dés en petits morceaux cube de 1 mm, et je viens de le faire avec l’aide de trypsine EDTA.
Par la suite, les cellules sont récoltées par centrifugation et plaquées dans un flacon adapté à la culture des cellules androgènes pendant 48 heures. Les cellules sont récoltées une fois de plus dans le flacon et cultivés jusqu’à nouvel usage. Les cellules primaires des microglies humaines peuvent maintenant être caractérisées par l’immunocytochimie et utilisées pour d’autres expériences.
Le principal avantage de notre protocole pour isoler les cellules de microglies des tissus cérébraux humains adultes est qu’il fournit effectivement les cellules primaires adultes de microglies humaines d’une manière très rentable. Le protocole est robuste et il réduit la perte de cellules en réduisant le nombre d’étapes utilisées dans les protocoles existants. Recueillir les tissus dans un tube Falcon de 50 mL contenant 10 mL d’aCSF glacé.
Essuyez soigneusement le tube de collecte avec 70% d’alcool et transférez-le dans une chambre d’écoulement d’air laminaire aseptique. Jetez soigneusement l’aCSF et pesez les tissus dans le tube Falcon. Calculez le poids environ des tissus en déduisant le poids du tube Falcon vide.
Chaud frais aCSF à 37 degrés centigrades. Gardez le tissu au chaud aCSF pendant cinq minutes. Cette étape est essentielle pour éviter la mort cellulaire.
Jetez soigneusement l’aCSF. Et laver les tissus une fois avec 1X PBS réchauffé à 37 degrés centigrades. Assurez-vous que tout le sang est emporté par des lavages répétés de PBS au besoin.
Incuber le tissu dans du PBS chaud pendant 5 minutes. Jetez soigneusement la moitié du PBS. Transférer le tissu avec le reste du PBS dans une boîte de Pétri stérilisée.
Retirer soigneusement le reste du PBS avec une pipette de 1 mL. Cela permettra d’éviter la perte de tissu. Couper ce problème en petits morceaux cubes d’au moins 1 mm à l’aide d’un scalpel stérile.
Ajouter 2 mL de 0,25% trypsine EDTA à la boîte de Petri et bien laver l’assiette à l’aide de pipette. Transférer le tissu en dés dans un tube Falcon de 50 mL contenant 10 mL par gramme de tissu de 0,25% trypsine EDTA. Mélanger au pipetage à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL.
Incuber le tube sur un shaker pendant 30 minutes à 37 degrés centigrades et la vitesse de 250 rpm. Ajouter 10 mL de milieu neutralisant pour neutraliser la trypsine. Bien mélanger avec une pipette sérologique de 10 mL.
Centrifugeuse du tube à 2000G à 4 degrés centigrades pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans 1 mL de milieu de culture. Déposer les cellules dans un flacon T25 adapté aux cellules androgènes et ajouter 4 mL de milieu de culture supplémentaire.
Le milieu culturel contiendra 20%L929 supernatant et 1% streptomycine. Il est recommandé d’ajouter le supernatant L929 séparément dans les flacons au lieu d’ajouter au milieu de culture des stocks. Nous en avons fini avec le flacon pour éliminer homogènement le tissu.
Évitez d’amener les médias au cou du flacon tout en secouant car cela peut augmenter les risques de contamination. Incuber le flacon à 37 degrés centigrades avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Recueillir les médias à partir de flacon de culture T25 préparé le jour 0 dans des tubes de centrifugeuse.
Centrifugeuse les médias recueillis à 1466G à 4 degrés centigrades pendant 4 minutes. Pendant que les supports collectés sont centrifugés, lavez le flacon jour 0 une fois avec 1X PBS. Secouez doucement le flacon pour enlever les fragments de tissu restants.
Évitez les secousses dures de la fiole car tout fragment de reste n’affectera pas négativement la culture. Ajouter 5 mL de culture fraîche dans le flacon. Jeter le surnatant des tubes centrifugés.
Ajouter 1 mL de culture moyenne à l’un des tubes et bien mélanger avec la pipette. Ajouter en série les supports mélangés avec des cellules à d’autres tubes et bien mélanger. Déposer les cellules dans un flacon T25 séparé adapté aux cellules androgènes.
Ajouter 4 mL de médias de culture frais à la fiole. Incuber les deux flacons à 37 degrés centigrades avec 5% de CO2 pendant 48 heures. Jetez les médias des deux flacons et ajoutez des supports culturels frais de 5 mL.
Incuber les flacons à 37 degrés centigrades à 5% de CO2 pendant 48 heures. Le sixième jour, les cellules seront prêtes pour d’autres expériences. Dans les images représentées ici.
Premier panneau de la section A astrocytes tachés de GFAP, de couleur verte. Dans le deuxième panneau, de la section A microglia tache avec RCA, vert en couleur. Dans la section B microglies tachées de RCA, qui est de couleur verte, et les astrocytes sont tachés de GFAP, de couleur rouge.
La superposition des images montre des microglies et des astrocytes ensemble. Il est clair d’après les images que la majorité des cellules de la culture préparées sont des microglies. Les images ont été quantifiées par un contrôle aveugle et le résultat est représenté dans la section C.Les résultats ont montré qu’environ 80% des cellules de la culture préparées sont des cellules microgliales.
Cette technique peut être effectuée en environ une heure et demie. Après cette procédure devrait avoir une bonne compréhension de la façon dont je sélectionne l’amorçage microglies à partir de tissus cérébraux humains adultes, qui peuvent être utilisés pour des expériences en aval.
