الهدف العام للبروتوكول هو عزل الخلايا الدقيقة الأولية من أنسجة الدماغ البشرية الحية للبالغين. في حالتنا، تم جمع هذه كنافذة جراحية أثناء الجراحة. ويتم ذلك عن طريق جمع أنسجة الدماغ في البداية في الجليد البارد PBS ، ثم يتم قطع الأنسجة إلى قطع مكعبات صغيرة 1 ملم ، وفعلت للتو بمساعدة التربسين EDTA.
بعد ذلك، يتم حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي ومطلية في قارورة مناسبة لثقافة الخلايا الاندروجين لمدة 48 ساعة. يتم حصاد الخلايا مرة أخرى من القارورة و مثقف حتى استخدام مزيد من. يمكن الآن أن تتميز الخلايا الدقيقة البشرية الأولية باستخدام الكيمياء المناعية وتستخدم لمزيد من التجربة.
والميزة الرئيسية لبروتوكولنا لعزل الخلايا الصغيرة من أنسجة الدماغ البشرية البالغة هي أنها توفر بشكل فعال خلايا ميكروجليا الإنسان البالغة الأولية بطريقة فعالة للغاية من حيث التكلفة. البروتوكول قوي و فإنه يقلل من فقدان الخلايا عن طريق تقليل عدد الخطوات المستخدمة في البروتوكولات الموجودة. جمع الأنسجة في أنبوب فالكون 50 مل تحتوي على 10 مل من الجليد aCSF الباردة.
امسح أنبوب الجمع بعناية مع 70٪ من الكحول ونقلها إلى غرفة تدفق الهواء المتعفنة. تخلص من aCSF بعناية ووزن الأنسجة في أنبوب فالكون. حساب الوزن تقريبا من الأنسجة عن طريق deducing وزن أنبوب فالكون فارغة.
دافئ aCSF الطازجة إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على الأنسجة في aCSF الحارة لمدة خمس دقائق. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية لتجنب موت الخلايا.
تجاهل ACSF بعناية. وغسل الأنسجة مرة واحدة مع 1X PBS ارتفعت درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. تأكد من غسل جميع الدم مع غسل برنامج تلفزيوني المتكررة حسب الحاجة.
احتضان الأنسجة في برنامج تلفزيوني دافئ لمدة 5 دقائق. تجاهل نصف برنامج تلفزيوني بعناية. نقل الأنسجة جنبا إلى جنب مع برنامج تلفزيوني المتبقية إلى طبق بيتري تعقيم.
إزالة برنامج تلفزيوني المتبقية بعناية مع ماصة 1 مل. وهذا سوف يمنع فقدان الأنسجة. النرد التي قضية على الأقل 1 ملم مكعب قطع صغيرة باستخدام مشرط معقم.
أضف 2 مل من 0.25٪ التربسين EDTA إلى طبق بيتري وغسل الطبق جيدا مع مساعدة من الماصات. نقل النسيج مكعبات إلى أنبوب فالكون 50 مل تحتوي على 10 مل لكل غرام من 0.25٪ التربسين EDTA. مزيج عن طريق الأنابيب من خلال ماصة المصلية 10 مل.
احتضان الأنبوب على شاكر لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية وسرعة 250 دورة في الدقيقة. إضافة 10 مل من تحييد المتوسطة لتحييد التربسين. اخلطي جيدا مع ماصة مصلية 10 مل.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 2000G في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. تجاهل افرا و resuspend بيليه في 1 مل من الثقافة المتوسطة. وضع الخلايا في قارورة T25 مناسبة لخلايا الاندروجين وإضافة 4 مل من ثقافة إضافية المتوسطة.
الثقافة المتوسطة سوف تحتوي على 20٪ L929 فائقة و 1٪ ستريبتوميسين. من المستحسن إضافة L929 supernatant بشكل منفصل في قارور بدلا من إضافة إلى الأسهم ثقافة المتوسطة. لقد انتهينا من القارورة للتخلص من الأنسجة بشكل متجانس.
تجنب جلب وسائل الإعلام إلى عنق القارورة في حين تهتز لأن هذا قد يزيد من فرص التلوث. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. جمع وسائل الإعلام من قارورة ثقافة T25 المعدة في اليوم 0 في أنابيب الطرد المركزي.
أجهزة الطرد المركزي وسائل الإعلام التي تم جمعها في 1، 466G في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق. في حين يتم طرد الوسائط التي تم جمعها ، اغسل قارورة اليوم 0 مرة واحدة مع PBS 1X. هز القارورة بلطف لإزالة أي بقايا الأنسجة شظايا اليسار.
تجنب اهتزاز قاسية من قارورة كما أي بقايا شظايا لن تؤثر سلبا على الثقافة. أضف 5 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة إلى القارورة. تجاهل المُندفع من الأنابيب المُهزّقة.
إضافة 1 مل من الثقافة المتوسطة إلى واحدة من الأنابيب واخلط جيدا مع ماصة. تسلسل إضافة الوسائط المختلطة مع الخلايا إلى أنابيب أخرى ومزيج شامل. وضع الخلايا في قارورة T25 منفصلة مناسبة لخلايا الاندروجين.
أضف 4 مل من وسائل الإعلام الثقافية الطازجة إلى القارورة. احتضان كل من القارورة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. تجاهل وسائل الإعلام من كل من القارورة وإضافة وسائل الإعلام ثقافة 5 مل جديدة.
احتضان القارورة في 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. في اليوم السادس، ستكون الخلايا جاهزة لمزيد من التجارب. في الصور الممثلة هنا.
اللوحة الأولى من القسم a astrocytes ملطخة بـ GFAP ، خضراء اللون. في اللوحة الثانية، من القسم وصمة ميكروجليا مع RCA، والأخضر في اللون. في القسم B microglia ملطخة RCA، وهو أخضر اللون، وstrocytes ملطخة بGFAP، والأحمر في اللون.
تراكب من الصور يظهر microglia وatrocytes معا. ومن الواضح من الصور أن غالبية الخلايا في الثقافة المعدة هي microglia. تم تحديد كمية الصور عن طريق السيطرة المكفوفين والنتيجة ممثلة في القسم C.The وأظهرت النتائج أن حوالي 80٪ من الخلايا في الثقافة المعدة هي خلايا microglia.
يمكن تنفيذ هذه التقنية في حوالي ساعة ونصف الساعة. بعد هذا الإجراء يجب أن يكون لها فهم جيد لكيفية تحديد microglia فتيلة من أنسجة الدماغ البشرية الكبار, التي يمكن استخدامها كذلك لتجارب المصب.
