Les auteurs sont reconnaissants à Lisa Hansen et Kirsten Vestergaard pour leur excellente assistance technique, ainsi qu’à P. Scherer, N. Joffin et C. Crewe pour la lecture critique du manuscrit. Les auteurs remercient le Flow Cytometry Core de l’UTSW pour ses excellents conseils et son aide dans l’élaboration des protocoles décrits ici. R.K.G. est pris en charge par NIDDK R01 DK104789, NIDDK RC2 DK118620 et NIDDK R01 DK119163. J.P. est financé par une bourse pré-doctorale du Fonds d’innovation du Danemark.

Tous les protocoles et procédures pour les animaux ont été approuvés par le comité institutionnel d’utilisation et de soins des animaux du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas.
1. Isolement de la fraction vasculaire stromale (SVF) à partir du tissu adipeux blanc gonadique
<ol><li>Disséquez le tissu adipeux blanc gonadique de souris âgées de 6 à 8 semaines et placez des coussinets adipeux dans une solution 1x PBS.</li>
	<li>Combinez jusqu’à 4 dépôts de graisse (2 à 4 dépôts de 1 à 2 souris recommandés) et hachez le tissu dans un bécher de 10 ml contenant 200 μL de tampon de digestion (1x HBSS, 1,5% BSA et 1 mg/mL de collagénase D).</li>
	<li>Transférez le tissu haché dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 10 ml de tampon de digestion.</li>
	<li>Incuber le mélange à 37 °C dans un bain-marie pendant 1 h en agitant.</li>
	<li>Filtrez le tissu digéré à travers une passoire cellulaire de 100 μm pour éliminer les tissus non digérés.</li>
	<li>Diluer l’échantillon filtré à 30 mL avec du PBS contenant 2 % de FBS, puis centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirez le surnageant, qui contient les adipocytes matures.</li>
	<li>Passez immédiatement à la méthode d’isolement cellulaire préférée.</li>
</ol>2. Isolation des APC et FIP à l’aide de FACS
<ol><li>Dissoudre la pastille dans 1 mL de 1 tampon de lyse RBC en secouant doucement le tube.</li>
	<li>Incuber à RT pendant 1 à 2 min.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de FBS/PBS à 2 % et passer à travers une crépine à cellules de 40 μm dans un tube à centrifuger propre de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le milieu et remettre en suspension la pastille dans 400-800 μL de bloc Fc à 2 % contenant du FBS/PBS (1:200).</li>
	<li>Incuber à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Transférez 400 μL-800 μL de suspensions cellulaires contenant ≤106 cellules par mL dans des tubes de 1,5 mL et ajoutez des anticorps. Les concentrations d’anticorps sont indiquées dans la section Tableau des matières .<ol><li>Préparez des tubes de contrôle séparés pour 1) les cellules non colorées, 2) les contrôles monocolores et 3) les contrôles FMO (fluorescence moins un).</li>
		<li>Colorer les échantillons avec des anticorps PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber à 4 °C pendant 15 min à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 400 μL de 2 % FBS/PBS.</li>
	<li>Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans 400-800 μL à 2 % FBS/PBS. Passez ensuite à travers des capuchons filtrants de 40 μm dans des tubes en polystyrène à fond rond de 5 mL pour FACS.</li>
	<li>Suivez les étapes suivantes pour le gating.<ol><li>Utilisez des commandes non colorées et unicolores pour la compensation.</li>
		<li>Utilisez les commandes FMO pour définir des portes expérimentales.</li>
		<li>Utilisez la stratégie de contrôle illustrée à la figure 1 pour obtenir des APC et des FIP. Les APC de porte sous forme de cellules CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C- CD9- et les FIP sous forme de cellules CD45- CD31- PDGFRβ+ LY6C+ .</li>
	</ol></li>
	<li>Recueillir les cellules triées dans des tubes contenant 500 μL de sérum à 100 % et maintenir les cellules sur de la glace.</li>
	<li>Cellules de centrifugation à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Ajouter 2 % de FBS/PBS pour laver les cellules en centrifugeant à nouveau à 600 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant, utilisez les cellules granulées.</li>
	<li>Remettre en suspension les cellules granulées dans le volume approprié de milieu de culture APC gonadique (pour la culture cellulaire) ou dans un tampon approprié pour une analyse ultérieure.</li>
</ol>3. Séparation immunomagnétique des fractions adipogéniques et non adipogènes
<ol><li>Isolez le SVF du tissu adipeux blanc gonadique en suivant les étapes 1.1-1.7.</li>
	<li>Aspirez le surnageant et mettez à nouveau en suspension la pastille SVF dans 10 mL de 1 tampon MS disponible dans le commerce.</li>
	<li>Filtrer la suspension cellulaire à travers une crépine de 40 μm.</li>
	<li>Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules granulées dans 100 μL de 1x MS Buffer.</li>
	<li>Effectuez la déplétion des cellules CD31+ et CD45+ comme indiqué ci-dessous (Figure 2A, étape 1). Ceci est fait pour éliminer les cellules endothéliales et hématopoïétiques.<ol><li>Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules et ajustez la concentration à ≤ 1 x 108 cellules/ml.</li>
		<li>Ajouter les anticorps CD31 et CD45 conjugués à la biotine à la suspension cellulaire, chacun à une concentration de ≤ 0,25 μg par 106 cellules et incuber sur glace pendant 15 min.</li>
		<li>Lavez les cellules en ajoutant 4 ml de 1x MS Buffer.</li>
		<li>Centrifugeuse à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Aspirez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec 100 μL de 1x tampon MS.</li>
		<li>Ajouter 10 μL de nanobilles de streptavidine et incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min.</li>
		<li>Lavez les cellules en ajoutant 4 ml de 1 tampon MS.</li>
		<li>Centrifuger à 600 x g pendant 5 min à 4 °C, puis aspirer le surnageant.</li>
		<li>Remettre les cellules en suspension dans 2,5 mL de tampon 1x MS et transférer dans un tube en polypropylène de 5 mL.</li>
		<li>Placez le tube dans la grille magnétique pendant 5 min.</li>
		<li>Prélever les cellules non marquées en versant la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger propre de 15 ml. REMARQUE : Évitez de secouer ou d’éponger les gouttelettes suspendues car cela entraîne une contamination par une fraction cellulaire indésirable.</li>
		<li>Retirez le tube de l’aimant et répétez les étapes 3.6.9. au 3.6.11. deux fois de plus pour un total de 3 lavages.</li>
	</ol></li>
	<li>Séparation des fractions adipogéniques et non adipogènes (Figure 2A, étape 2)<ol><li>Continuez à travailler avec la fraction non étiquetée (c’est-à-dire la fraction CD45--CD31-).</li>
		<li>Centrifuger le tube de 15 mL contenant des cellules non marquées à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de 1x tampon MS.</li>
		<li>Ajouter des anticorps LY6C et CD9 conjugués à la biotine, respectivement, à une concentration de ≤ 0,25 μg par 106 cellules et incuber sur glace pendant 15 min.</li>
		<li>Suivez les étapes 3.6.3. au 3.6.12. pour compléter la deuxième séparation.</li>
		<li>Collecter les fractions non liées. Les cellules non marquées (LY6C-CD9-) représentent une fraction adipogénique contenant des APC (Figure 2A, Étape 3).</li>
		<li>Retirez le tube de l’aimant, remettez en suspension et éluez les cellules liées dans 1x tampon MS. Les éluats ou fraction marquée (LY6C+ CD9+) représentent une fraction non adipogénique contenant des FIP (Figure 2A, étape 3).</li>
		<li>Centrifuger les fractions marquées et non marquées à 600 x g pendant 5 min jusqu’aux cellules de granulés à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Passer immédiatement à la culture cellulaire (étape 6) ou utiliser des précurseurs indifférenciés pour les analyses souhaitées (étape 4 et/ou étape 5).</li>
</ol>4. Évaluer la pureté des fractions adipogéniques et non adipogéniques par cytométrie en flux
<ol><li>Mettre en suspension des fractions cellulaires isolées par des billes dans 200 à 400 μL de bloc Fc contenant 2 % de FBS/PBS (1:200).</li>
	<li>Incuber à 4 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL et ajoutez des anticorps. Les concentrations d’anticorps sont indiquées dans le tableau des matières.<ol><li>Préparez des tubes de contrôle séparés pour 1) les cellules non colorées, 2) les commandes monocolores et 3) les commandes FMO.</li>
		<li>Aux échantillons, ajoutez des anticorps CD45, CD31, CD9 et LY6C.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuber à 4 °C pendant 15 min à l’abri de la lumière.</li>
	<li>Centrifuger à 600 x g pendant 5 minutes à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer des cellules surnageantes et les remettre en suspension dans 400 μL de FBS/PBS à 2 %.</li>
	<li>Centrifuger la suspension à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 400-800 μL de 2% FBS/PBS. Filtrer à travers des capuchons filtrants de 40 μm dans des tubes à fond rond en polystyrène de 5 mL pour analyse par cytométrie en flux.</li>
	<li>Analyse par cytométrie en flux pour évaluer la pureté<ol><li>Utilisez des commandes non colorées et unicolores pour la compensation.</li>
		<li>Utilisez les commandes FMO pour définir des portes expérimentales.</li>
		<li>Utilisez la stratégie de contrôle pour les cellules actives et uniques, comme illustré à la figure 2B.</li>
		<li>Effectuez le déclenchement comme illustré à la Figure 2B pour les CD45, CD31, LY6C et CD9.</li>
		<li>Utilisez un logiciel de cytométrie en flux pour évaluer les fréquences des cellules CD45- CD31- LY6C- CD9- (APC) et des cellules CD45- CD31- LY6C+ (FIP) au sein de fractions isolées.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse de l’expression génique par PCR quantitative pour évaluer la pureté des FIP et des APC
<ol><li>Extraire l’ARNm de cellules isolées magnétiquement ou FACS à l’aide d’un kit d’extraction disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Utilisez 1 μg d’ARN pour synthétiser l’ADNc à l’aide d’un kit de transcriptase inverse de l’ADNc (voir le tableau des matériaux) en suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Déterminez les niveaux relatifs d’ARNm des gènes sélectifs APC et FIPs (Tableau 1) par PCR quantitative à l’aide du master mix de PCR verte SYBR.<ol><li>Configurez la réaction de l’échantillon pour la PCR comme suit : 5 μL de colorant vert 2x SYBR, 1 μL d’ADNc (~50 ng/μL), 0,5 μL de chaque amorce directe et inverse (10 μM) et 3 μL d’eau.</li>
		<li>Utiliser les conditions standard de PCR suivantes pour l’exécution de la PCR quantitative : étape de maintien : 50 °C pendant 2 min, 95 °C pendant 10 min ; Étape de PCR (40 cycles) : 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Normalisez les valeurs aux niveaux du gène d’entretien ménager (Rps18) en calculant ΔΔ-Ct.</li>
	<li>Pour évaluer la signification statistique, effectuez le test t de Student non apparié.</li>
</ol>6. Culture cellulaire et différenciation
<ol><li>Centrifuger les cellules isolées magnétiquement ou FACS à 600 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Remettre la pastille en suspension dans 500 μL de milieu de culture APC gonadique et déposer une plaque de 40 000 cellules/puits à partir de chaque fraction d’une plaque de culture de 48 puits.</li>
	<li>Remplacez le support tous les 1 à 2 jours. Les APC commenceront à se différencier en adipocytes à mesure qu’ils approchent de la confluence. Les PIF maintenues dans le même milieu résistent à l’adipogenèse.</li>
</ol>

<ol>
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T.A.P. est employé et actionnaire de Novo Nordisk A/S

La souche C57BL/6 de souris est la souche de souris la plus utilisée dans les études sur l’obésité induite par l’alimentation. Les souris C57BL/6 prennent rapidement du poids lorsqu’elles sont soumises à un régime riche en graisses (HFD) et développent certaines des caractéristiques principales du syndrome métabolique associé à l’obésité (par exemple, la résistance à l’insuline et l’hyperlipidémie). Notamment, l’expansion de WAT se produisant en association avec une alimentation riche en gra...

Le tissu adipeux blanc (WAT) représente le principal site de stockage d’énergie chez les mammifères. Dans ce tissu, les adipocytes, ou « cellules adipeuses », stockent les calories en excès sous forme de triglycérides, emballés dans de grosses gouttelettes lipidiques uniloculaires. De plus, les adipocytes sécrètent une multitude de facteurs qui régulent divers aspects de l’homéostasie énergétique 1,2,3. Les adipocytes constituent l’essentiel du volume de WAT ; cependant, les adipocytes ne représentent que moins de 50% du total des cellules présentes dans WAT 4,5. Le compartiment non adipocytaire de la WAT, ou fraction stroma-vasculaire (SVF), est assez hétérogène et contient des cellules endothéliales vasculaires, des cellules immunitaires résidentes des tissus, des fibroblastes et des populations de cellules précurseurs adipocytaires (APC).
WAT est exceptionnel dans sa remarquable capacité à s’étendre en taille à mesure que la demande de stockage d’énergie augmente. Le maintien de cette plasticité tissulaire est essentiel car un stockage adéquat des lipides dans le WAT protège contre le dépôt ectopique de lipides délétères dans les tissus non adipeux6. La manière dont les dépôts WAT individuels subissent cette expansion en réponse à l’excès calorique est un déterminant essentiel de la sensibilité à l’insuline dans le contexte de l’obésité7. L’expansion pathologique des WAT, observée chez les individus obèses atteints du syndrome métabolique, est caractérisée par une expansion préférentielle des dépôts viscéraux des WAT au détriment du tissu adipeux sous-cutané métaboliquement favorable. De plus, la résistance à l’insuline dans l’obésité est associée à un remodelage pathologique du WAT. Celle-ci se caractérise par une croissance hypertrophique des adipocytes existants (augmentation de la taille), une angiogenèse inadéquate, une inflammation métabolique chronique, une accumulation de composants de la matrice extracellulaire (fibrose) et une hypoxie tissulaire 8,9. Ces phénotypes WAT de l’obésité sont associés à une stéatose hépatique et à une résistance à l’insuline, similaires à ce qui est observé dans l’état de lipodystrophie (absence de WAT fonctionnelle). En revanche, l’expansion saine des WAT est observée dans la population obèse métaboliquement saine et est caractérisée par une expansion préférentielle des WAT sous-cutanés protecteurs et une expansion de dépôt par hyperplasie adipocytaire10. Le recrutement de nouveaux adipocytes est médié par la différenciation adipocytaire de novo à partir des cellules précurseurs adipocytaires (APC) (appelée « adipogenèse »). L’hyperplasie adipocytaire coïncide avec des degrés relativement plus faibles de fibrose WAT et d’inflammation métabolique 6,11. Une multitude de types de cellules au sein du microenvironnement WAT influencent directement la santé et l’expansibilité de WAT dans l’obésité12. À ce titre, la définition de la fonction des différents types de cellules présentes dans WAT reste une priorité élevée pour le domaine.
Au cours de la dernière décennie, plusieurs stratégies ont été employées pour définir et isoler les APC natifs de WAT SVF13 chez l’homme et la souris. De telles stratégies isolent les CPA en fonction de l’expression à la surface cellulaire de marqueurs de cellules souches mésenchymateuses et de cellules progénitrices communes à l’aide de techniques de séparation cellulaire à base d’anticorps. Ces approches comprennent le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), l’utilisation d’anticorps marqués au fluorophore ou la séparation immunomagnétique des billes (c’est-à-dire des anticorps chimiquement modifiés). Les protéines de surface cellulaire ciblées pour l’isolement des APC comprennent PDGFRα, PDGFRβ, CD34 et SCA-1. Ces approches ont contribué à enrichir pour les APC ; Cependant, les populations cellulaires isolées sur la base de ces marqueurs sont assez hétérogènes. Des études très récentes de séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) ont mis en évidence l’hétérogénéité moléculaire et fonctionnelle des cellules stromales au sein de la fraction stromale-vasculaire (SVF) isolée du WATmurin 14,15,16,17. À partir de nos propres analyses fonctionnelles et de scRNA-seq, nous avons identifié et caractérisé des sous-populations de cellules périvasculaires PDGFRβ+ immunomodulatrices et adipogéniques fonctionnellement distinctes dans le compartiment stromal du WAT intra-abdominal chez des souris adultes15. Les précurseurs fibro-inflammatoires, ou FIP, représentent une sous-population importante de cellules PDGFRβ+ et peuvent être isolés sur la base de l’expression de LY6C (cellules LY6C+ PDGFRβ+)15. Les FIP n’ont pas de capacité adipogénique, exercent une forte réponse pro-inflammatoire à divers stimuli, produisent du collagène et sécrètent des facteurs anti-adipogènes15. L’activité pro-inflammatoire et fibrogénique de ces cellules augmente en association avec l’obésité chez la souris, impliquant ces cellules en tant que régulateurs du remodelage de WAT. La sous-population LY6C- CD9- PDGFRβ+ représente les cellules précurseurs adipocytaires (CPA). Ces APC sont enrichis dans l’expression de Pparg et d’autres gènes pro-adipogènes, et se différencient facilement en adipocytes matures in vitro et in vivo15. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement de ces populations cellulaires distinctes à partir de dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes à l’aide de FACS, et la séparation immunomagnétique des billes avec des anticorps biotinylés. Ce protocole peut être utilisé pour isoler des sous-populations de progéniteurs adipeux fonctionnellement distinctes à partir de plusieurs dépôts WAT intra-abdominaux de souris mâles et femelles adultes15. L’étude isolée de ces populations cellulaires fonctionnellement distinctes pourrait grandement contribuer à notre compréhension actuelle des mécanismes moléculaires qui régulent l’adipogenèse et le remodelage du tissu adipeux intra-abdominal dans la santé et la maladie.
Le protocole ci-dessous détaille l’isolement des progéniteurs adipeux à partir du WAT épididymaire murin ; cependant, la même procédure peut être utilisée pour isoler les cellules correspondantes des dépôts WAT mésentériques et rétropéritonéaux des souris mâles et femelles15. Un protocole détaillé sur la façon d’identifier et d’isoler ces dépôts chez la souris peut être trouvé dans Bagchi et al.18. Ce protocole a été optimisé pour l’utilisation de souris âgées de 6 à 8 semaines. La fréquence et la capacité de différenciation des CPA peuvent diminuer en association avec le vieillissement.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 and 100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352340/352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21040CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml polypropylene tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion Buffer (for 10mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H8264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088882001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.15 g BSA (1.5 % final cc.)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1605-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5X MojoSort Buffer (MS buffer)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml MojoSort Magnet (MS magnet)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L MojoSort Streptavidin Nanobeads</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>480015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purity Check and FACS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Red Blood Cell Lysis Buffer</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-4300-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc block (Mouse CD16/CD32)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD45</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103103</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD31</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102503</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: MEC13.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin CD9</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124803</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: MZ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin LY6C</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128003</td>
			<td>Concentration: &#8804; 0.25 &#181;g per 10^6 cells 
			Species: Mouse 
			Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>102419</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-PerCP/Cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103131</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD140b PDGFR&#946;-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>136006</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:50 
			Species: Mouse 
			Clone: APB5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY6C-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>128016</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: HK1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>124808</td>
			<td>Concentration: Dilution 1:400 
			Species: Mouse 
			Clone: MZ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture and Differentiation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gonadal APC Culture media (for 500mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>288 mL DMEM with 1 g/L glucose</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>192 mL MCDB201</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>12303C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL 100% ITS premix</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 &#181;L 100 g/ml FGF-basic</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>3139-FB-025/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Pen/Strep</td>
			<td>Corning</td>
			<td>30-001-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 &#181;L Gentamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots

La fraction stromo-vasculaire (SVF) du tissu adipeux blanc (WAT) est remarquablement hétérogène et se compose de nombreux types de cellules qui contribuent fonctionnellement à l’expansion et au remodelage du WAT à l’âge adulte. Un obstacle considérable à l’étude des implications de cette hétérogénéité cellulaire est l’incapacité à isoler facilement des sous-populations cellulaires fonctionnellement distinctes de la FVS WAT pour les analyses in vitro et in vivo. La technologie de séquençage unicellulaire a récemment permis d’identifier des sous-populations de cellules périvasculaires PDGFRβ+ fibro-inflammatoires et adipogéniques fonctionnellement distinctes dans les dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes. Les progéniteurs fibro-inflammatoires (appelés « FIP ») sont des cellules productrices de collagène non adipogéniques qui peuvent exercer un phénotype pro-inflammatoire. Les cellules précurseurs adipocytaires (APC) PDGFRβ+ sont hautement adipogènes à la fois in vitro et in vivo lors de la transplantation cellulaire. Ici, nous décrivons plusieurs méthodes pour l’isolement de ces sous-populations de cellules stromales à partir de dépôts WAT intra-abdominaux murins. Les FIP et les APC peuvent être isolés par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou en tirant parti de la technologie des billes immunomagnétiques à base d’anticorps biotinylés. Les cellules isolées peuvent être utilisées pour l’analyse moléculaire et fonctionnelle. L’étude isolée des propriétés fonctionnelles de la sous-population de cellules stromales élargira nos connaissances actuelles sur le remodelage du tissu adipeux dans des conditions physiologiques ou pathologiques au niveau cellulaire.

Ce protocole décrit deux stratégies qui permettent d’isoler des populations distinctes de cellules stromales à partir de dépôts WAT intra-abdominaux de souris adultes. Les CPA et les FIP peuvent être isolés par FACS (Figure 1) ou par séparation immunomagnétique des billes avec des anticorps biotinylés (Figure 2). Les deux approches utilisent des réactifs et des anticorps qui sont tous disponibles dans le commerce. La séparation immunomagnétique de...

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Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

isolation-adipogenic-fibro-inflammatory-stromal-cell-subpopulations

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

2.4K vues.  Novo Nordisk A/S. Ce protocole décrit l’approche technique permettant d’isoler des sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts de tissu adipeux blanc (WAT) intra-abdominal murin par tri cellulaire activé par fluorescence ou séparation immunomagnétique des billes.

Vidéo: Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Isolement de tissu adipeux cellules immunitaires

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Recherche

Immunologie et infection

Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Isolement de cellules murines ganglions lymphatiques stromales

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolement, Expansion et adipocytaire Induction de CD34 + CD31 + des cellules endothéliales du tissu adipeux humain épiploïques et sous-cutanée

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

Étude simultanée du recrutement des sous-populations de Monocyte sous flux In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected in the urinary tract. The protocol can be broadly divided into three sections: the infection, bladder epithelial cell harvesting, and mouth micropipetting to isolate individual infected epithelial cells. The isolated epithelial cell contains viable bacterial cells and is nearly free of contaminating extracellular bacteria, making it ideal for downstream single-cell analysis. The time taken from the start of infection to obtaining a single intracellular bacterial community is about 8 h. This protocol is inexpensive to deploy and uses widely available materials, and we anticipate that it can also be utilized in other infection models to isolate single infected cells from cell mixtures even if those infected cells are rare. However, due to a potential risk in mouth micropipetting, this procedure is not recommended for highly infectious agents.

This protocol describes a simple method of isolating single, infected-bladder epithelial cells from a murine model of urinary tract infection.

Isolement des simples communautés bactériennes intracellulaires généré à partir d’un modèle murin d’Infection des voies urinaires pour l’analyse de cellules individuelles en aval

In this article, we outline a procedure used to isolate individual intracellular bacterial communities from a mouse that has been experimentally infected ...

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

Isolement des cellules mononucléaires Lamina Propria du colon murine à l'aide de la collagène E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Isolement des sous-ensembles macrophages et des cellules stromales des spécimens myocardiques humains et de souris

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs contain both multilocular lipid droplets and abundant mitochondria, and they express uncoupling protein 1 (UCP1). BAs are categorized into two sub-types based on their origin: embryo derived classical BAs (cBAs) and white adipocytes derived BAs. Due to their relatively low density, BAs cannot be isolated from BAT with traditional centrifugation method. In this study, a new method was developed to isolate BAs from mice for gene and protein expression analysis. In this protocol, interscapular BAT from adult mice was digested with Collagenase and Dispase solution, and the dissociated BAs were enriched with 6% iodixanol solution. Isolated BAs were then lysed with Trizol&#160;reagent for simultaneous isolation of RNA, DNA, and protein. After RNA isolation, the organic phase of the lysate was used for protein extraction. Our data showed that 6% iodixanol solution efficiently enriched BAs without interfering with follow-up gene and protein expression studies. Platelet-derived growth factor (PDGF) is a growth factor that regulates the growth and proliferation of mesenchymal cells. Compared to the brown adipose tissue, isolated BAs had significantly higher expression of Pdgfa. In summary, this new method provides a platform for studying the biology of brown adipocytes at a single cell-type level.

This study describes a new method of isolating murine brown adipocytes for gene and protein expression analysis.

Isolement des adipocytes bruns du tissu adipeux brun interscapulaire murin pour l’analyse de l’expression génique et protéique

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...