L’importance du protocole repose sur la signalisation membrane à noyau et n’affecte pas directement le génome, comme c’est le cas avec les cellules souches pluripotentes induites. La nature non tératogène des cellules souches pluripotentes dérivées du sang est le principal avantage de la technique, ce qui la rend adaptée à une application clinique sûre dans divers domaines de la médecine régénérative. La Dre Anne-Kathrin Schott, chef de projet, et Oksana Greenacre, assistante de laboratoire dans mon laboratoire, démontrent la procédure.
Pour isoler les PBMNCs, ajouter 25 millilitres de sang un-à-un dilué avec du PBS à 10 millilitres de milieu de gradient de densité et centrifuger le mélange à 300 fois G pendant 30 minutes. Isolez la couche d’interface entre le plasma et le gradient de densité par pipetage. Laver les cellules isolées avec cinq millilitres de PBS stérile et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes.
Après avoir répété la procédure deux fois, comptez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Ajouter 6 par 10 aux 6èmes cellules mononucléaires à un tube de 15 millilitres, puis effectuer la réticulation des anticorps en ajoutant de l’anticorps spécifique à la protéine de membrane GPI-linked humain aux cellules dans pbs avec 1%BSA et en incubant pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après la réticulation, remplacez le milieu d’incubation par le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove complété par 10 % de FBS.
Cultivez les cellules dans des tubes de polystyrène de 15 millilitres en les plaçant dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 8 à 10 jours sans trembler. Le cinquième jour, ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de Medium d’Iscove complétés par 10% FBS à chaque tube de 15 millilitres. Comptez les cellules cultivées avec une chambre de comptage.
Centrifuger ensuite la suspension cellulaire d’environ 5 par 10 jusqu’aux 6ème cellules à 300 fois G pendant 10 minutes et aspirer le surnageant résultant avec une pipette Pasteur stérile. Ressusciter la pastille cellulaire dans 90 microlitres de PBS pré-refroidi de pH 7,2 avec 0,5% BSA et deux EDTA millimolaires. Ajoutez ensuite 80 microlitres CD-45 perles magnétiques nano-tailles positives à la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 15 minutes.
Pour laver les cellules, ajouter deux millilitres de tampon PBS et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes. Ressuscitez les cellules dans 500 microlitres de tampon PBS. Lavez la colonne avec 500 microlitres de tampon PBS pré-refroidi et placez-la dans le champ magnétique.
Placez la suspension cellulaire sur la colonne et lavez-la deux fois avec 500 microlitres de tampon PBS. Recueillir les cellules dans le milieu d’Iscove complété avec 1%BSA et compter les cellules dans la chambre de comptage. Placez les lamelles de verre dans des plaques de quatre puits et recouvrez-les d’une à cinq poly-L-ornithine diluée et d’eau doublement distillée.
Après avoir incubé les lamphes à 37 degrés Celsius pendant une heure, lavez-les avec de l’eau double distillée. Décongeler lentement 0,5 à deux milligrammes par millilitre de laminine et l’ajouter au sommet des lamaux. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis enlever l’excès de laminine par pipetage et ajouter le milieu neuronal N2 aux plats de culture.
Culture bd-dérivés cd-45 cellules négatives dans le milieu N2 sur des laminines ornithine-enrobées de verre pendant deux jours dans un incubateur avec 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pour initier une différenciation neuronale des cellules nouvellement générées bd. Ensuite, culturez les cellules dans un milieu de différenciation neuronale et placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 16 jours. Préparez un fixateur avec 75 millilitres d’eau stérile et quatre grammes de paraformaldéhyde.
Ajouter 10 hydroxyde de sodium normal au besoin en agitant jusqu’à ce que la solution se dégage. Ajouter le mélange de saccharose à la solution et le titrer à un pH de 7,4 avec six acides chlorhydriques normaux. Porter le volume à 100 millilitres avec de l’eau stérile.
Après avoir retiré le milieu de la culture cellulaire, incuber avec un fixateur de prémède pendant 15 minutes, puis jeter le fixateur et laver les cellules trois fois pendant cinq minutes chacune. Ajoutez immédiatement une solution de Triton-X à 0,3% fraîchement fabriquée et perméabilisez les cellules pendant cinq minutes. Laver trois fois avec du PBS et ajouter une solution bloquante de PBS et de BSA à 5%.
Bloquer les cellules à température ambiante sur une plaque à bascule pendant une heure. Préparer une dilution appropriée des anticorps dans du PBS BSA à 1 % et incuber les cellules avec les anticorps sur une plaque à bascule pendant 1,5 heure à température ambiante. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage.
Incuber les cellules avec DAPI et monter les lamèdes avec un support de montage pour la visualisation dans un microscope. L’aspect morphologique des cellules dedifferentiated de BD a été étudié les jours un, cinq, et 10, montrant une tendance de la disparition progressive des cellules non activées et une nouvelle population de croissance constante des cellules dans la culture activée. Les cellules dedifferentiated de BD étaient petites et ont montré les caractéristiques des cellules agranular non mûres avec moins d’organites et de grands noyaux avec la chromatine condensée semblable à ESCs.
Des cellules ont été étudiées pour la re-différenciation de neuro après culture dans des plats de culture laminine-enrobés pendant 30 jours. Dès quatre jours, les premières cellules neuronales avec de longues structures ramifiées ont pu être détectées. La plupart des petites cellules sphériques se sont développées en cellules ramifiées avec des formes allongées plus grandes, ce qui implique un processus actif vers la différenciation des lignées neuronales.
Le corps cellulaire et les processus des cellules ont montré une complexité plus élevée que les cellules indifférenciées, présentant une densité élevée de bonnet endoplasmique rugueux et de faisceaux de filaments d’actine. Les cellules se développant dans des milieux de différenciation ont fréquemment établi des contacts de cellule à cellule impliquant le corps cellulaire, tandis que d’autres ont impliqué des processus cellulaires de manière neurite-like. L’analyse d’Immunochimie exécutée utilisant les anticorps spécifiques a confirmé que les cellules dedifferentiated de BD sont capables de re-différenciation vers de diverses lignées neuronales, y compris des astrocytes de GFAP.
Cette technique permet de créer des cellules autologues non tératogènes capables de se re-différencier en cellules des trois couches germinales, ouvrant ainsi de nouvelles opportunités dans la recherche en médecine régénérative.
