Comprendre le mode d’action des nouveaux composés antibactériens est une tâche importante mais difficile. Cette méthode donne un aperçu de ces mécanismes et il est facile à implémenter. Cette technique permet une observation en temps réel des effets antibactériens d’une manière non invasive permettant une analyse plus poussée de l’échantillon.
Bien que la pratique avec des techniques microbiologiques soit une condition préalable, l’expérience est facile à réaliser. Prendre votre temps avec l’analyse des données est très important lors de l’exécution de la microcalorimétrie pour la première fois. Commencez par utiliser un spectrophotomètre à une longueur d’onde de 600 nanomètres pour mesurer la densité optique de la culture nocturne.
Diluer la culture à 5 fois 10 à la 5ème colonie formant des unités par millilitre de concentration moyenne fraîche de MHB et ajouter 150 microlitres de cellules à chaque tube d’antibiotique de 1,5 millilitre à la concentration d’intérêt. Ensuite, mélanger le composé avec les cellules par vortex. Pour préparer les inserts, ajouter 120 microlitres de chaque mélange d’antibiotiques bactéries dans des inserts individuels en plastique dans les puits appropriés d’une plaque de 48 puits et utiliser des pinces à épiler pour placer tous les flacons de titane dans les porte-porte.
Transférer délicatement les inserts dans les flacons de titane dans la plaque du support et placer lâchement les couvercles de titane sur tous les flacons. Lorsque tous les inserts ont été transférés, placez le support sur la zone désignée sur la station d’échantillonnage et utilisez une clé de couple réglée à 40 mètres centinewton pour serrer tous les couvercles. Dans le logiciel système, démarrer une nouvelle expérience et retirer le bras d’insertion de l’échantillon de l’instrument.
Placez le porte-gobelet sur le pont avec la colonne huit face à l’ouverture d’insertion de l’échantillon et poussez doucement le porte-gobelet dans l’instrument à la position 1. Attendez 10 minutes pour que le système se stabilise avant d’étiqueter les puits expérimentaux. Ensuite, poussez le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce que le porte-gobelet soit à la position deux.
Après avoir permis au système de se stabiliser pendant 20 minutes, poussez le bras d’insertion de l’échantillon pour en positionner trois et rétractez le bras d’insertion de l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit en position de course. Mettez en surbrillance tous les puits du logiciel et sélectionnez le démarrage de la réaction, puis exécutez l’expérience jusqu’à ce que les lisages d’émission de chaleur soient habilement de retour à zéro. À la fin de l’analyse, sélectionnez arrêt.
Le logiciel vous demandera alors si vous en êtes sûr. Sélectionnez oui et enregistrez l’expérience pour l’analyse des données. Insérez ensuite complètement le bras d’insertion de l’échantillon dans l’instrument et engagez les aimants pour récupérer le porte-gobelet.
Pour analyser les données, ouvrez le logiciel et sélectionnez l’expérience ouverte. Dans la fenêtre popup, sélectionnez l’expérience d’intérêt et cliquez sur ouvrir. Cliquez sur sélectionnez tous et définissez la ligne de base pour normaliser les données dans chaque position.
Dans la fenêtre popup, sélectionnez une période de temps supérieure à 30 minutes dans la phase de décalage. Après sélection, la ligne de base apparaîtra en vert dans le thermogramme. Fermez la fenêtre définir la section de base, puis cliquez sur enregistrer et fermer le logiciel.
Ensuite, ouvrez l’application d’analyse calorimétrique SymCel basée sur le Web. Cliquez sur parcourir pour télécharger le fichier d’intérêt et sélectionnez l’expérience. Les paramètres métaboliques seront automatiquement calculés pour les 32 échantillons.
Pour adapter les données de flux de chaleur aux modèles Gompertz et/ou Richards Growth, cliquez sur fonction de croissance. Les modèles de croissance seront affichés dans la section cumulative pour comparaison avec les données brutes de la section flux. Pour télécharger les paramètres calculés, cliquez sur les mesures de téléchargement, sélectionnez l’emplacement du fichier et cliquez sur enregistrer.
Le fichier sera exporté vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Ici, les thermogrammes obtenus en exposant A.baumannii DSM-30008 à la ciprofloxacine dans la dilution en série sont affichés. Les concentrations entre 0,005 et 0,1 micromolaire ont un effet minimal sur la croissance et le métabolisme d’A.baumannii.
Le traitement des cellules avec 0,5 micromolaire ciprofloxacine, cependant, conduit à un changement significatif dans la durée de la phase de décalage et à un débit de chaleur maximum inférieur. Ces deux changements affectent ensemble le temps de pointe, ce qui entraîne une augmentation d’environ six heures. Dans ce chiffre, la chaleur cumulative libérée est tracée contre le temps avec l’effet de chaque concentration reflétée par une pente de pente.
Quantification de l’inclinaison thermogramme permet le calcul du taux métabolique maximum de A.baumannii en présence de ciprofloxacine avec une diminution concomitante du taux métabolique observé dans les cellules traitées avec 0,5 ciprofloxacine micromolaire. Le traitement à la rifampicine a un effet dramatique sur les thermogrammes d’A.baumannii DSM-30008. Une réduction significative des émissions de chaleur corrélatrice avec une diminution de l’activité métabolique est également observée.
Notez l’augmentation du temps de pointe pour toutes les concentrations testées et la diminution du taux métabolique causée par la diminution de la pente pour toutes les concentrations qui sont habituellement attribuées à un effet bactéricide. Pour obtenir des résultats optimaux, utilisez le tuyautage inversé et empêchez le liquide supplémentaire sur les côtés de l’insert lors du transfert de l’échantillon, assurez-vous également que les couvercles sont bien fermés.
