Cette méthode permet à des personnes sans expertise en électronique de construire des instruments tels que ce fluorimètre pour l’amplification et la détection des acides nucléiques isothermes, ce qui est essentiel pour le diagnostic moléculaire. Le principal avantage de cette technique est que le système peut être entièrement assemblé à partir de matériaux disponibles dans le commerce et de logiciels open source à faible coût. Ce fluorimètre peut être utilisé avec plusieurs méthodes d’amplification isotherme.
Ceci est important parce que les méthodes d’amplification isotherme sont de plus en plus utilisées pour détecter un large éventail de maladies infectieuses et héréditaires. Pour assembler le boîtier optique, placez un insert fileté de 3/16 pouces de long de 4 à 40 dans le trou au-dessus de la pièce STL inférieure de l’enceinte optique et placez un insert fileté de 4 à 40 de 1/4 de pouce de long dans tous les autres trous de la pièce. Insérez la carte de test centrale dans la cavité supérieure du boîtier avec les cinq broches orientées vers le haut et les plus proches de l’axe central de l’appareil et fixez la carte de test avec une vis 4-40 de 3/16 de long.
Placer l’une des lentilles de distance focale de 20 millimètres dans la section située sous la planche centrale d’essai, le côté convexe faisant face vers le bas de l’appareil et à l’écart de la planche d’essai. Pour créer la première configuration, placez le filtre passe-longue dans la section suivante sous l’objectif de distance focale de 20 millimètres. Pour créer la deuxième configuration, placez deux feuilles de filtre d’émission jaunes dans la section sous l’objectif.
Pour créer la première configuration, placez le miroir dichroïque dans la section diagonale près du centre de l’enveloppe tout en observant l’orientation du filtre spécifiée par le fabricant. Pour créer la deuxième configuration, placez le séparateur de poutre dans la section diagonale. Placez une deuxième lentille de distance focale de 20 millimètres dans la section sous le miroir dichroïque ou le séparateur de faisceau en fonction de la configuration, le côté convexe pointant vers le haut de l’appareil.
Pour créer la première configuration, placez le filtre d’excitation dans la section à droite du miroir dichroïque, en vous assurant que la flèche pointe vers le miroir dichroïque. Pour créer la deuxième configuration, placez une feuille de filtre d’excitation bleue dans la section à droite du séparateur de faisceau. Placez la lentille de distance focale de 15 millimètres à droite du filtre d’excitation, le côté convexe faisant face au miroir dichroïque.
Et placez une LED dans la section restante de l’impression avec la LED tournée vers le miroir dichroïque ou le séparateur de faisceau, selon la configuration. Assurez-vous que les deux fils menant de la LED sont insérés dans les canaux d’évidement afin que l’impression se ferme hermétiquement. Et répétez la configuration de l’autre côté de la pièce d’impression 3D.
Placez ensuite les parties extrudées de la moitié supérieure de l’enveloppe dans les rainures encastrées de la moitié inférieure de l’enveloppe pour fermer le côté vide de la pièce avec les composants optiques. Et fixez les pièces avec des vis de 3/8 de long de 4 à 40. Pour assembler l’électronique et l’écran tactile, connectez les deux mini planches à pain et placez le microcontrôleur dans l’une des planches à pain, en veillant à ce que le port micro-USB du microcontrôleur soit tourné vers l’extérieur.
Pour connecter la modulation LED, connectez la broche CTL du pilote LED+ à une broche numérique du microcontrôleur. Et la broche LED du pilote LED à une broche GND du microcontrôleur. Retirez les couvercles en plastique à l’arrière des planches à pain et appuyez sur le support adhésif des planches à pain sur la partie imprimée en 3D pour fixer les planches à pain combinées à l’intérieur de la partie arrière de la pièce imprimée STL support d’écran LCD.
Fixez le support d’écran LCD avec les planches à pain assemblées à l’intérieur du boîtier optique avec des vis 4-40 de long de 1 pouce. Pour connecter le bloc d’alimentation LED, connectez la broche LED positive du pilote LED au fil positif du premier VOYANT. Et connectez le fil négatif de la première LED au fil positif de la deuxième LED sur la planche à pain.
Connectez le fil négatif de la deuxième LED à la broche LED du pilote LED. Pour connecter l’alimentation LED, utilisez un adaptateur jack barillet à 2 broches pour connecter les fils positifs et négatifs de l’alimentation de 10 volts aux broches VIN + et VIN du pilote LED, respectivement. Pour connecter l’alimentation de la carte de test du capteur et le transfert de données, utilisez un fil de cavalier femelle à mâle à 4 broches pour connecter les broches SCK, SDA, VDUT et GND des cartes de test du capteur lumière-numérique à la mini planche à pain à travers l’espace en haut à droite de l’impression du support LCD.
Sur la planche à pain, vérifiez que la broche de 3,3 volts du microcontrôleur et la broche VDUT des deux cartes de test, la broche GND du microcontrôleur et la broche GND des deux cartes de test, la broche analogique 4 broches du microcontrôleur et la broche SDA des deux cartes de test, et la broche analogique 5 broches du microcontrôleur et la broche SCK des deux cartes de test sont toutes connectées. Utilisez quatre vis M2.5 pour fixer l’ordinateur monoc carte sur le support d’écran LCD, avec les ports HDMI et adaptateur secteur de l’ordinateur monocré orienté vers le haut et l’ordinateur monocré centré sur la partie imprimée en 3D. Ensuite, connectez l’écran tactile à l’ordinateur monoc carte selon les instructions de l’écran tactile.
Et connectez le port HDMI de l’ordinateur monoc carte au port HDMI de l’écran tactile. Pour enregistrer les données de fluorescence en temps réel, une fois que le bloc thermique a été allumé et a atteint la température appropriée, allumez l’ordinateur monocteur et utilisez un câble micro-USB vers USB pour connecter l’ordinateur monocteur au microcontrôleur. Ouvrez le script Python fourni sur l’écran tactile et modifiez l’heure de mesure.
Remplacez le chemin d’accès du fichier de sortie variable par le nom du fichier de données généré par le programme. Et changez les variables de port série aux valeurs souhaitées. Placez deux tubes PCR contenant les réactions à surveiller dans le bloc thermique.
Et placez le fluorimètre sur le bloc thermique avec les tubes PCR centrés entre les quatre chevilles extrudant de chaque canal optique. Après avoir confirmé que le fluorimètre imprimé en 3D est connecté, branchez l’adaptateur d’alimentation pour les LED et démarrez le programme Python. Une interface utilisateur graphique apparaîtra sur l’écran LCD pour mesurer la fluorescence en temps réel dans les deux tubes PCR.
À la fin de l’expérience, affichez les mesures et les fichiers de données en sortie enregistrés dans l’emplacement défini par l’utilisateur. Une fois assemblé, les performances du fluorimètre peuvent être validées en mesurant la fluorescence d’une série de dilutions de colorant FITC. Dans cette analyse représentative, les deux canaux du fluorimètre ont montré une réponse linéaire dans la plage souhaitée.
On voit ici la fluorescence soustraite par la ligne de base du positif d’amplification de la recombinase polymérase et les réactions de contrôle négatives d’un kit commercial standard mesurées sur la deuxième configuration du fluorimètre. Les mesures de fluorescence en temps réel d’une réaction d’amplification isotherme à médiation par boucle de transcription inverse personnalisée pour l’ARN du SRAS-COVID-2 sur la première configuration du fluorimètre montrent que l’amplification se produit comme prévu sur une plage cliniquement pertinente de nombres de copies d’ARN. À une époque où les chaînes d’approvisionnement mondiales sont très stressées, des équipements open source comme ce fluorimètre peuvent nous aider à réduire certaines des inégalités en matière de santé associées à la pandémie.
