Nous voulons créer un modèle d’AVC qui produit un caillot sanguin similaire aux échantillons de patients et qui répond au traitement thrombolytique cliniquement pertinent. Par conséquent, nous modifions le modèle classique de l’AVC photothrombotique et mélangeons la thrombine et le colorant photodynamique rose bengal avant la photoactivation. Nous sommes heureux que cette procédure crée effectivement des caillots sanguins très sensibles à la thrombolyse médiée par le tPA.
Ce modèle d’AVC photothrombotique modifié utilisant des procédures chirurgicales très simples avec un faible taux de mortalité a produit une taille et une localisation d’infarctus très constantes. Vous produisez également un caillot sanguin mixte de fibrine et de plaquettes qui est similaire à ceux du patient victime d’un AVC aigu. Par conséquent, nous pensons qu’il est très utile pour la recherche préclinique sur l’AVC de développer des thérapies thrombolytiques plus efficaces.
Nous espérons que davantage de personnes utiliseront notre modèle. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Yu-Yo Sun, notre professeur adjoint de recherche dans notre groupe. 30 minutes avant l’intervention, préparez la souris en lui injectant un analgésique.
Après avoir anesthésié la souris, effectuez un pincement des orteils pour vous assurer qu’elle est complètement anesthésiée. Retirez ensuite les poils du cou et de la tête gauches avec une crème dépilatoire. Placez la souris sur l’adaptateur pour petit animal en position couchée sur le dos et stérilisez la zone cutanée chirurgicale en l’essuyant avec trois coups alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70 %.
Sous un microscope à dissection, faites une incision cervicale gauche de 0,5 centimètre à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite à environ 0,2 centimètre latéralement de la ligne médiane. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces finement dentelées, séparez les tissus mous et le fascia pour exposer le LCCA. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces fines et lisses, séparez soigneusement le LCCA du nerf vagal.
Placez une suture permanente à double nœud autour du LCCA à l’aide d’une suture en soie 5-0. Retournez la souris en position couchée et faites pivoter le rouleau du pince-nez de 15 degrés. Stérilisez ensuite la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois coups alternés de bétadine et d’éthanol à 70 %.
Faites une incision de 0,8 centimètre dans le cuir chevelu à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite le long de l’œil et de l’oreille gauches pour exposer le muscle temporal. Ensuite, faites une incision de 0,5 centimètre le long du bord du muscle temporal sur l’os pariétal gauche. Ensuite, faites une deuxième incision verticale de 0,3 centimètre sur le muscle temporal et rétractez le muscle pour exposer le bord de l’os pariétal et de l’os squamosal.
Assurez-vous de visualiser le point de repère de la suture coronale entre les os frontal et pariétal. Ensuite, humidifiez le crâne en appliquant une solution saline stérile pour révéler le MCA gauche, et marquez la branche proximale du MCA sur l’os squamosal avec un marqueur. Tracez délicatement un cercle d’un millimètre de diamètre autour de cette zone marquée à l’aide d’une perceuse pneumatique.
Ensuite, amincissez le crâne d’environ 0,2 millimètre de profondeur sans toucher la dure-mère inférieure. Arrêtez le forage lorsqu’il reste une très fine couche d’os. Ensuite, mélangez la solution de thrombine et de rose bengale en fonction du poids corporel de la souris et injectez lentement le mélange dans le sinus rétro-orbitaire avec une aiguille de calibre 31.
Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Appliquez l’illuminateur avec une lumière laser de 532 nanomètres sur le site foré à une distance de deux pouces pendant 20 minutes. Visualisez l’éclairage au niveau de la branche proximale du MCA à l’aide de lunettes de projection laser.
Après 20 minutes, arrêtez l’éclairage laser. Faites une fenêtre crânienne de trois millimètres de diamètre sur l’os pariétal du crâne et placez une vitre de protection dessus. Localisez ensuite le MCA distal sous une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x.
Étiquetez la plaquette circulante par injection dans la veine caudale de l’anticorps anti-GP1b-bêta conjugué DyLight 488 cinq minutes avant l’imagerie. Ensuite, injectez rétro-orbitalement le mélange de solution de thrombine et de rose bengale. Photoactivez le MCA à l’aide d’un système laser de 532 nanomètres avec un faisceau laser de 10 micromètres de diamètre, et enregistrez l’image jusqu’à la formation du thrombus.
Pour l’administration de tPA, placez l’animal anesthésié sur un tampon chaud à 37 degrés Celsius. Enveloppez sa queue d’une gaze humide chaude à 45 degrés Celsius pendant une minute au point de temps post-photoactivation sélectionné. Ensuite, injectez le tPA humain recombinant par la veine caudale.
Injectez 50 % en bolus et perfusez les 50 % restants pendant 30 minutes à l’aide d’une pompe à perfusion. Pour surveiller le flux sanguin cérébral, faites une incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne exposé. Hydratez le crâne avec une solution saline stérile et appliquez doucement le gel à ultrasons dessus, en veillant à éviter les poils ou les bulles d’air dans le gel.
Surveillez le flux sanguin cérébral dans les deux hémisphères cérébraux sous l’imageur de contraste laser pendant 10 minutes. Le marquage par immunofluorescence montre que dans la photothrombose à base de colorant rose bengale, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41 positives et de peu de fibrine. En revanche, dans la photothrombose thrombine plus rose bengale, la branche MCA a été occluse par des caillots de plaquettes et de fibrine mélangés au hasard.
L’analyse par immunotransfert a montré une augmentation de plus de deux fois du dépôt de fibrine dans l’hémisphère ipsilatéral dans la photothrombose de la thrombine et du bengale de rose par rapport à la photothrombose du bengale de rose seule. L’imagerie intravitale au microscope confocal a montré qu’une injection intraveineuse de thrombine ne parvenait pas à induire des agrégats plaquettaires, même sous éclairage laser. Les plaquettes ont formé des caillots homogènes dans le modèle de photothrombose du bengale rose, mais des agrégats inégaux avec de multiples régions faibles dans le modèle de la thrombine et du bengale rose.
Le CBF de la même souris avant et 24 heures après le traitement par tPA par rapport au traitement par véhicule a été mesuré par imagerie par contraste de chatoiement laser et normalisé à l’hémisphère controlatéral. Dans la photothrombose du Bengale rose, le traitement par tPA a conduit à une tendance à la récupération du CBF, en particulier dans la zone de la frontière ischémique par rapport aux souris traitées par véhicule. Dans la photothrombose de la thrombine et de la rose bengale, la récupération du CBF chez les souris traitées par tPA était plus importante, et les branches proximales de l’ACM devenaient souvent visibles à 24 heures.
Dans la photothrombose du Bengale rose, une taille d’infarctus similaire a été détectée chez des souris traitées par véhicule et traitées par tPA. En revanche, dans la photothrombose de la thrombine et du bengale rose, le traitement lytique tPA a significativement réduit l’infarctus à 0,5, une ou deux heures, mais pas six heures après la photoactivation par rapport aux souris traitées par véhicule, La génération de fibrine médiée par la thrombine est cruciale pour la formation de thrombus dans cette procédure. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la composition des caillots et pour étudier plus en détail les traitements thrombolytiques.
À la suite de cette procédure, d’autres méthodes de traitement par thrombolyse peuvent être appliquées et l’efficacité ultérieure déterminée. L’ajout de thrombine permet d’ajuster la composition du caillot de pauvre en fibrine à riche en fibrine, ce qui permet aux chercheurs de développer des stratégies thérapeutiques cliniquement pertinentes.
