La fusion membranaire médie de nombreuses fonctions biologiques. Ce protocole décrit une méthode pour détecter l’ouverture des pores de fusion et la dynamique de libération du transmetteur et distinguer trois modes de fusion: fusion fermée, fusion de séjour et fusion rétrécie. La combinaison du microscope confocal et de l’enregistrement patch-clamp facilite la visualisation de l’ouverture et de la fermeture des pores de fusion et la détermination de leur cinétique.
Bien que décrit pour les cellules chromaffines, le principe de la méthode décrite ici peut être largement appliqué à de nombreuses cellules sécrétoires bien au-delà des cellules chromaffines. La mise en œuvre réussie de cette méthode dépend de plusieurs étapes générales, telles que la génération d’une culture de cellules chromaffines primaires saines, une efficacité de transfection suffisante des plasmides et un taux de réussite élevé de l’enregistrement électrophysiologique. Choisissez trois glandes intactes sans coupures ni saignements à la surface et retirez le tissu adipeux avec des ciseaux.
Lavez les glandes par perfusion avec la solution de Locke jusqu’à ce qu’aucun sang ne sorte. Pour la digestion, injectez la solution enzymatique à travers la veine surrénale à l’aide d’une seringue de 30 millimètres attachée avec un filtre de 0,22 micromètre jusqu’à ce que la glande commence à gonfler. Ensuite, laissez les glandes à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.
Injectez à nouveau et laissez les glandes à 37 degrés Celsius pendant encore 10 minutes. Après la digestion, coupez la glande longitudinalement de la veine surrénale à l’autre extrémité avec des ciseaux pour déplier la glande. Isolez la médulla blanche en la pressant en morceaux dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant la solution de Locke.
Couper et hacher la moelle avec des ciseaux. Filtrer la suspension médullaire avec un maillage en nylon de 80 à 100 micromètres dans un bécher. Transférer le filtrat dans un tube conique de 50 millilitres et centrifuger à 48 x g température ambiante pendant trois minutes avec une décélération de trois.
Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule avec la solution de Locke par pipetage. Filtrer la suspension cellulaire avec une crépine de 80 à 100 micromètres et centrifuger à 48 x g température ambiante pendant trois minutes avec décélération trois. Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire avec 30 millilitres de milieu de culture.
Déterminez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage hémocytométrique. Transférer 2 800 000 cellules dans un tube de 15 millilitres. Abattez les cellules par centrifugation à 48 x g pendant deux minutes avec la décélération de trois.
Ajouter 100 microlitres de tampon de transsection fournis par le fabricant à la pastille de cellule. Et puis ajoutez deux microgrammes de plasmide PH-mNG. Mélanger doucement la suspension en canalisant la solution de haut en bas et transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation sans délai.
Transférez immédiatement la cuvette dans l’électroporateur, sélectionnez le programme 005 dans la liste des écrans et appuyez sur Entrée pour effectuer l’électroporation. Après électroporation, ajouter immédiatement 1,8 millilitre de milieu à la cuvette et mélanger doucement avec une micropipette équipée d’une pointe stérile. Ajouter 300 microlitres de la suspension des cellules électroporées sur le couvercle dans chaque plat en plaquant cinq à six plats au total pour une réaction d’électroporation.
Transférer soigneusement les plats dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 9% de dioxyde de carbone pendant 30 minutes et ajouter doucement deux millilitres de milieu préavertissé à chaque plat après 30 minutes. Préparez des pipettes de patch à partir de capillaires en verre borosilicate en les tirant avec un extracteur de pipette, en enrobant leurs pointes de cire liquide et en les polissant avec une microforge. Allumez l’amplificateur d’enregistrement à pince de patch et démarrez le logiciel.
Définissez les paramètres d’enregistrement du courant de calcium et de la capacité appropriés du logiciel. Définissez un protocole d’enregistrement d’une durée totale de 60 secondes où la stimulation commence à 10 secondes. Réglez le potentiel de maintien pour l’enregistrement de la pince de tension à 80 millivolts.
Définissez une dépolarisation d’une seconde de moins 80 millivolts à 10 millivolts comme stimulus pour induire l’afflux de calcium et le saut de capacité. Allumez le système de microscope confocal et définissez les paramètres appropriés dans le logiciel. Allumez les lasers, y compris 458 nanomètres, 514 nanomètres et 633 nanomètres et définissez la plage de collecte des émissions pour chaque laser en fonction de chaque sonde de fluorescence.
Choisissez un plat avec un bon état cellulaire et une expression correcte et ajoutez deux microlitres de faux neurotransmetteur de fluorescence FFN511 dans le milieu dans le plat. Remettez le plat dans l’incubateur pendant 20 minutes. Après avoir chargé FFN511, préparez la chambre d’enregistrement et ajoutez deux microlitres de colorant de fluorescence A655 dans 50 microlitres de solution de bain.
Transférez le couvercle du plat dans la chambre d’enregistrement avec une pince à épiler et ajoutez immédiatement la solution de bain contenant de l’A655. Placez une goutte d’huile sur l’objectif d’immersion dans l’huile 100X. Montez la chambre dans le microscope et utilisez le bouton de réglage pour que l’huile entre simplement en contact avec le fond du couvercle.
Mettez les cellules au point et utilisez l’imagerie en champ lumineux et confocale pour trouver une cellule appropriée avec une expression mNG. Effectuez un zoom avant sur la cellule sélectionnée et centrez-la dans le champ de vision, en minimisant les zones vides. Définissez les paramètres de l’imagerie confocale du plan XY sur un plan Z fixe de FFN511, PH-mNG et A665 avec un intervalle de temps réduit.
Réglez la mise au point au bas de la cellule à l’aide d’un bouton de réglage fin. Ajustez la puissance du laser d’excitation dans le logiciel pour trouver un réglage permettant d’obtenir le meilleur rapport signal/bruit et d’éviter un blanchiment important par fluorescence. Ajouter neuf microlitres de solution interne dans une pipette de patch et fixer la pipette au support de l’étage d’amplification de la pince de patch.
Appliquez une petite pression positive avec une seringue et déplacez l’embout de la pipette pour toucher la solution de bain avec un micromanipulateur. Assurez-vous que l’amplificateur montre que la résistance de la pipette est approximativement comprise entre deux et quatre mégaohms avec un test d’impulsion de tension. Appuyez sur LJ/Auto pour annuler la jonction liquide.
Déplacez la pipette vers la cellule sélectionnée à l’aide d’un micromanipulateur. Pour former un mode attaché à une cellule, déplacez l’embout de la pipette pour toucher la cellule. Changez le potentiel de maintien de zéro à moins 80 millivolts tout en appliquant une légère pression négative avec une seringue.
Une fois que la résistance dépasse un gigaohm, attendez environ 30 secondes pour que la configuration se stabilise. Appuyez sur C-fast/Auto pour compenser la capacité rapide. Pour former un mode de vente en gros, appliquez des impulsions courtes mais puissantes de pression négative avec la seringue jusqu’à ce que la membrane se rompe.
Appuyez sur C-slow/Auto pour compenser la capacité lente. Ajustez légèrement la mise au point de l’imagerie pour faire la mise au point sur le fond de la cellule. Démarrez simultanément l’imagerie en accéléré confocale et l’enregistrement de la pince de patch en cliquant sur les boutons Démarrer avec deux applications logicielles différentes.
Après l’enregistrement, assurez-vous que les données sont enregistrées. Modifiez le potentiel de retenue à zéro millivolts. Retirez la pipette de la solution de bain et jetez-la.
Ouvrez les fichiers d’imagerie bruts auprès de n’importe quel fabricant ou logiciel fourni. Allez dans Processus, cliquez sur ProcessTools et utilisez les outils pour générer des fichiers de moyenne mobile pour chaque image en accéléré. Enregistrez ces fichiers.
Sous Quantifier, allez dans Outils et cliquez sur les boutons Profil de pile pour vérifier les points de temps avant et après la stimulation et identifier les changements de fluorescence dans chaque canal. Cliquez sur le bouton Dessiner l’ellipse pour encercler les régions d’intérêt pour les événements de fusion. Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Enregistrer les rois pour enregistrer.
Cliquez sur Ouvrir les projets pour localiser le fichier brut. Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Charger les retours sur investissement pour charger le fichier ROI dans le fichier d’imagerie brut afin de mesurer les intensités de fluorescence. Allez dans Outils et cliquez sur Trier les rois dans le logiciel et tracez les traces pour les trois canaux de chaque retour sur investissement.
Cliquez sur Rapport pour enregistrer les données de retour sur investissement, y compris les données numériques et les traces d’imagerie pour chaque retour sur investissement dans un dossier de fichiers. L’enregistrement et l’application d’une dépolarisation d’une seconde de 80 à 10 millivolts ont été effectués pour évoquer l’exo et l’endocytose. La dépolarisation appliquée a induit un courant de calcium vers l’intérieur, un saut de capacité, indiquant une exocytose, et une désintégration de la capacité après le saut, indiquant une endocytose.
Avec l’imagerie en accéléré au fond de la cellule, les événements de fusion induits par le protocole de dépolarisation d’une seconde ont été indiqués comme une diminution du FFN reflétant la libération de FFN511, accompagnée d’une augmentation de la fluorescence des points FPH et A655, reflétant la diffusion du PH-mNG et de l’A655 de la membrane plasmique et de la solution de bain dans la vésicule de fusion. La figure présente une fusion étroite identifiée comme une gradation F655, tandis que FPH s’est maintenu ou s’est décomposé avec un retard. La figure représente la fusion de séjour détectée par la présence de taches PH-mNG et A655.
La figure représente la fusion rétractable détectée comme une désintégration parallèle FPH et F655 accompagnée d’une réduction parallèle de la taille du spot PH-mNG et du spot A655 L’enregistrement réussi nécessite de générer toute la configuration de la cellule avec patch-clamp et imagerie au fond de la cellule avec une intensité fluorescente appropriée pour chaque canal. La combinaison de l’électrophysiologie et de la microscopie à super résolution décrite ici est un outil précieux pour mesurer la dynamique des pores de fusion et les neurocircuits.
