Ce protocole est conçu pour découvrir les bactéries dans les tissus ovariens et prédire leurs fonctions. La coloration immunohistochimique et le séquençage de l’ARNr 16S ont été utilisés afin de découvrir et de distinguer in situ les bactéries dans les tissus ovariens cancéreux et non cancéreux. La compensation et les différences fonctionnelles des bactéries sont prédites en utilisant les BoPs et l’étude cellulaire-génétique des communautés par reconstruction de jours non observés.
Notre protocole vise à extraire les bactéries des tissus ovariens in situ. Il peut également être utilisé pour découvrir des bactéries dans des tumeurs de toutes sortes. Les principaux avantages de notre protocole sont qu’il est facile et pratique, qu’il peut être réalisé dans presque tous les laboratoires.
Il est également rapide d’obtenir les résultats. Pendant la pratique du protocole, il est important d’exclure toute bactérie hors site des tissus tumoraux. Ainsi, toutes les procédures de ce protocole doivent être stériles.
Pendant la chirurgie, séparez les ovaires réséqués en échantillons de tissus d’environ un centimètre d’épaisseur avec une paire de nouvelles pinces stériles. Évitez de toucher quoi que ce soit d’autre pendant toute la procédure. Après la séparation, retirez l’échantillon dans un tube stérile et mettez-le dans de l’azote liquide pour la transmission.
Conserver les échantillons à moins 80 degrés Celsius. Fixez les tissus par le for formel, puis incorporez-les paraffine. Ce protocole peut être mis en pause ici.
Les tissus peuvent être conservés à température ambiante pour une conservation plus longue. Afin d’opérer d’autres étapes, coupez les échantillons en sections série de cinq micromètres. Ensuite, séchez les échantillons.
Faire de la paraffine et de la réhydratation aux échantillons. Pour récupérer l’antigène, un traitement par micro-ondes de 10 minutes dans un tampon EDTA est nécessaire. Trempez les échantillons dans du PBS qui contient 0,3% d’hydrogène.
Peroxydez pendant 20 minutes pour arrêter l’activité endogène de la peroxydase. Effectuer l’anticorps EMA au cœur du LPS, à une concentration de 1 sur 300. Et maintenez-le pendant une nuit à quatre degrés Celsius.
Afin de découvrir les bactéries, utilisez un kit de substrat DAP pour détecter l’existence de HRP. Sur la base des instructions d’un fabricant, utilisez un polymère HRP, anticorps anti-lapin. Utilisez un concentrateur de table pour laisser les anticorps se combiner complètement.
Utilisez pbS pour éliminer les anticorps non fédés. Faites votre coloration chimique selon les instructions du fabricant, puis rincez les échantillons sous l’eau. Faites la déshydratation des échantillons.
Échantillons de costumes en signant. Et entrez en tant qu’exemple à l’aide de la bibliothèque d’imagerie Pro Plus Prepare basée sur le protocole du fabricant. Pratiquez le modèle d’amorce, qui se compose des séquences spécifiques au gène et des séquences nucléotidiques en surplomb de l’adaptateur Illumina.
Pour amplifier les taux de natalité pour la région V4 des bactéries 16 sur les séquences de gènes d’ARNr, amplifiez le modèle à partir de l’entrée de l’échantillon d’ADN en utilisant la PCR amplicon. Utilisez les billes magnétiques Mag-Bind RxNPure Plus pour éliminer le mélange réactionnel du produit PCR. Effectuez une amplification PCR indexée pour la deuxième fois.
Utilisez Agilent 2200 TapeStation pour vérifier la bibliothèque. Utilisez le système dsDNA QuantiFluor pour quantifier la bibliothèque. Avec un cycle de 600, la cellule d’écoulement standard v3 produit environ 100 000 extrémités appariées.
2 fois 300 base 3. Les bibliothèques sont dénormalisées, regroupées et séquencées. Les taux bruts de chaque échantillon sont filtrés sur la base de la qualité du séquençage par Trimmomatic.
Les séquences d’amorce et d’adaptateur doivent toutes deux être retirées. Les lectures de séquence avec une paire et des qualités inférieures à 25 doivent être raccourcies. Analysez l’ARNr 16s par le progiciel QIIME.
Rassembler des séquences pour former des OTU avec un seuil de similitude à 97 % Pour les OTU, l’abondance relative doit être calculée dans chaque échantillon. Utilisez un classificateur bayésien, qui se trouve dans l’ensemble de formation RDP pour trier toutes les séquences. Avec un OTU donné, une classification qui a la cohérence majeure des séquences est attribuée aux OTU.
Les OTU sont alignés sur la base de données Silva, sur la base d’un exemple d’informations de groupe. Effectuez la diversité alpha et l’analyse des coordonnées principales basée sur UniFrac. Pour prédire la présentation des caractéristiques des bactéries, utilisez BugBase.
Prédire la composition fonctionnelle d’un métagénome à PICRUSt. Avec l’utilisation de données de surveillance et d’une base de données contenant des génomes de référence, analysez les différentes fonctions de chaque groupe à l’aide du logiciel STAMP. Utilisez un logiciel de statistiques pour calculer le résultat.
L’indication de la signification statistique doit être fixée à p inférieur à 0,05. Calculez les facteurs de confusion, qui comprennent l’âge et la parité, par le test t de Student. Calculer l’état ménopausique, les antécédents d’hypertension et de diabète par le test du Chi carré.
Calculer le nombre de taxons de bactéries ovars par le test Mann-Whitney U. 16 patients ont été inclus dans cette étude. BugBase a été utilisé pour pratiquer l’analyse des métagénomes prédits.
La pathogenétique et l’immunohistochimie potentielle des ovaires à l’aide d’anticorps antibactériens LPS. Cette figure montre la richesse et la diversité bactériennes dans les groupes cancéreux et témoins. Révélé par le séquençage de l’ARNr 16S.
Les chiffres sont l’indice des espèces observées. Indice Chao1, indice ACE, indice Shannon, indice Evenness, indice Simpson, respectivement. L’abondance relative des phyla et des 12 espèces bactériennes les plus abondantes dans les échantillons ovariens est montrée dans cette figure.
Figure A, B, C et D.Signifie l’abondance relative du panel dans les ovaires des patientes du groupe témoin et du groupe cancer de l’ovaire. Les abondances relatives des douze espèces de bactéries les plus abondantes dans les ovaires des patientes témoins et du groupe du cancer de l’ovaire. Il s’agit des plus courants, regroupés à l’aide de PCoA et de l’abondance relative d’Anoxynatronum sibiricum et de Methanosarcina vacuolata.
La figure A montre les plus courants, qui ont été regroupés à l’aide de PCoA. PC1 et PC2 sont tracés sur x et l’axe des y. Le bloc rouge est égal à l’échantillon du groupe du cancer de l’ovaire.
Le cercle bleu est égal à un échantillon du groupe témoin. Les échantillons du groupe du cancer de l’ovaire peuvent être séparés des autres échantillons du groupe témoin. La figure B montre les plus courants qui ont été regroupés à l’aide de PCoA.
PC1 et PC2 sont tracés sur les axes x et y. Le bloc rouge est égal à un échantillon du groupe du cancer de l’ovaire. Le cercle solide bleu est égal à un échantillon de la patiente atteinte d’un myome utérin.
Et le cercle creux bleu est égal à un échantillon d’une patiente atteinte d’adénomyose utérine. La figure C montre l’abondance relative d’Anoxynatronum sibiricum. La figure D est Methanosarcina vacuolata.
Ce chiffre est l’analyse BugBase de la métagénomique prédite. Le phénotype potentiellement pathogénétique et oxydatif de tolérance au stress des ovaires du groupe cancéreux était plus fort que celui du groupe témoin. Cette figure est significativement différente de l’espace de chemin KEGG entre les groupes de cancer et de contrôle par analyse PICRUSt.
Lorsque nous recevons nos échantillons, une paire de nouvelles pinces à épiler stériles est nécessaire. Faites attention à la contamination potentielle des échantillons. Que les bactéries hors site des tissus tumoraux peuvent affecter grandement la résolution.
Il est préférable de définir le groupe de contrôle à chaque étape. Afin de réduire l’effet de contamination potentielle.
