L’étude de la réponse aux dommages de l’ADN est nécessaire pour comprendre la physiopathologie des biomarqueurs potentiels du cancer de l’ovaire dans le cadre d’une nouvelle thérapie ciblée. Cette technique permet à l’échantillon de rester intact et permet l’examen des antigènes dans leur lieu d’action. Ce protocole est rapide et peut être adapté à tout antigène susceptible d’immunofluorescence.
Cette méthode donne un aperçu du cancer de l’ovaire et des processus de réparation des dommages à l’ADN impliqués dans la chimiothérapie et la résistance aux inhibiteurs de PARP. Ces méthodes peuvent être appliquées à d’autres domaines d’étude impliquant l’utilisation de cultures 3D et d’organoïdes. Pour commencer, aspirez les milieux des organoïdes irradiés et incubés sans perturber la matrice 3D.
Ensuite, lavez avec 300 microlitres de PBS. Fixez les organoïdes dans 300 microlitres de paraformaldéhyde à 2% pendant 10 minutes. Après la fixation, lavez les organoïdes avec 300 microlitres de tampon de coloration et placez-les sur un agitateur pendant cinq minutes.
Perméabiliser ensuite l’organoïde en ajoutant doucement 300 microlitres de tampon de perméabilisation. Après 20 minutes d’incubation, retirez le tampon et lavez avec 300 microlitres de tampon de coloration. Placez les organoïdes sur un shaker pendant cinq minutes.
Ensuite, ajoutez 300 microlitres de tampon de coloration pour bloquer l’étape de perméabilisation. Placer sur le shaker pendant 30 minutes et aspirer le tampon de coloration à l’aide d’une pipette. Ajoutez ensuite 300 microlitres d’anticorps primaires dilués dans un tampon de coloration.
Incuber à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Après l’incubation, retirez la solution d’anticorps primaire. Effectuez trois lavages avec 300 microlitres de tampon de coloration pendant cinq minutes chacun sur le shaker.
Ajouter 300 microlitres de solution d’anticorps secondaire diluée dans un tampon de coloration et incuber pendant une heure dans l’obscurité. Après une heure, aspirez la solution d’anticorps secondaire et ajoutez 300 microlitres de DAPI dilué. Placer sur le shaker pendant cinq minutes.
Effectuez trois lavages avec 300 microlitres de tampon de coloration pendant cinq minutes chacun sur le shaker. Retirez le tampon de coloration et détachez les chambres à l’aide du kit de retrait fourni avec les lames de chambre. Coupez la pointe d’une pointe de pipette P200 et utilisez-la pour ajouter un support de montage afin de couvrir chaque puits contenant une languette organoïde.
Placez un couvercle sur l’échantillon tout en évitant les bulles. Prenez du vernis à ongles transparent et peignez-le sur les côtés du verre de couverture pour sceller la lame. Laissez durcir pendant une heure, puis placez-le à 20 degrés Celsius.
Acquérir des images à l’aide d’un microscope confocal à l’aide d’un objectif 63X avec de l’huile d’immersion. À l’aide de ce protocole, des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes ont été colorés pour les protéines de réparation des dommages à l’ADN avant et après l’irradiation, et évalués pour des biomarqueurs tels que gamma H2AX, un marqueur des dommages à l’ADN, et RAD51, un marqueur pour la réparation de la recombinaison homologue. La RPA, un marqueur du stress de réplication, 53BP1, un marqueur de l’enjonction non homologue, et Geminin, un marqueur du cycle cellulaire en phase GS2 ont également été évalués à l’aide de cette technique.
Les comprimés BME ont tendance à se dépolymériser, il est donc essentiel de porter une attention particulière après la fixation et l’aspiration. L’analyse des antigènes pour déterminer les dommages aux organoïdes et la capacité de monter une réponse aux dommages à l’ADN pourrait aider à évaluer la résistance chimiothérapeutique.
