Les métastases sont l’une des principales causes de décès liés au cancer. Ce phénomène se produit lorsque les cellules cancéreuses se détachent de la tumeur primaire, vont dans la circulation sanguine pour finalement atteindre un organe cible éloigné. Une fois que ces cellules détachées vont dans le sang, nous les appelons cellules tumorales secondaires.
Ils représentent un matériau variable car d’une part, ils sont les principaux responsables de la formation de métastases et d’autre part, ils sont plus faciles que les biopsies tumorales. En effet, ils peuvent être prélevés par une simple ponction de sang. Malgré le faible nombre de ces cellules dans l’échantillon de sang, nous sommes les premiers à établir plusieurs lignées cellulaires tumorales circulantes à partir du sang du patient le plus préoccupant en utilisant la condition contrôlée en 3D.
Cette lignée cellulaire peut être utilisée dans n’importe quelle lignée cellulaire commerciale pour des expériences de routine. Par exemple, pour le dépistage génétique des médicaments, pour les protéines d’intérêt, mais aussi pour l’expérience in vivo pour tester la capacité d’initiation tumorale et leur potentiel métastatique. CTC, lignées cellulaires tumorales circulantes, doivent être cultivées dans des conditions 3D en hypoxie.
Une fois que le CTC a formé des sphères, nous pouvons le mettre dans le milieu et le centrifuger pendant cinq minutes à 300 RCF. Jetez le surnageant et ajoutez 500 microlitres d’Accumax. Nous en suspendons un et incubons la solution 20 minutes à 37 degrés.
Ensuite, lavez les sphères dissociées avec du PBS et abattez les cellules. Remettez en suspension la pastille avec un DMEM/F12 fraîchement supplémenté et voyez les cellules à la densité de cinq cellules par microlitre dans une nouvelle plaque 24 Low Attachment. Centrifuger les sphères CTC éliminent le surnageant et lavent la pastille deux fois avec du PBS.
À 500 microlitres de PFE, mélangez bien et incubez le tube sur de la glace pendant 20 minutes. Ensuite, centrifugez les sphères fixes et lavez la pastille deux fois avec du PBS, éliminant ainsi le volume maximal de PBS et ajoutez 20 microlitres d’HistoGel formé. Mettez-le en suspension et faites une gouttelette sur le vase de culture, laissez-le sécher pendant 10 minutes et détachez-le à l’aide d’un scalpel.
Vous pouvez maintenant traiter pour n’importe quel désiré afin de CTC ciblant une protéine d’intérêt souhaitée. Collectez les CTC et dissociez les sphères avec Accumax comme décrit précédemment. Éliminez l’Accumax et remettez en suspension la pastille avec trois mL de tampon bloquant et transférez la suspension à travers une passoire cellulaire de 14 micromètres pour obtenir une solution à cellule unique.
Comptez les cellules et expédiez-les dans des tubes et ajoutez un volume de 200 000 cellules, centrifugez les tubes et jetez le surnageant. Selon la fiche technique de l’anticorps, ajoutez dans un tube, le volume souhaité de l’anticorps et dans un autre tube son isotype et continuez les étapes en suivant les directives du fabricant. Le tube restant ne sera pas étiqueté et l’utilisation d’un marché de viabilité est fortement suggérée dans cette expérience.
Sur le cytomètre, commencez par le tube non marqué pour régler la tension dans la zone marquée négativement. Ensuite, placez le tube isotype. L’isotype servirait de contrôle négatif pour distinguer le signal positif du signal non spécifique.
Et terminez l’expérience avec les cellules marquées avec l’anticorps d’intérêt où vous devriez voir un changement dans la porte marquée positivement, si la protéine d’intérêt est exprimée. Cette suspension dissocie les CTC dans un milieu supplémenté à la densité de 200 000 cellules par mL. Dans une fixation Ultra Low 96, plaque de puits, sceller le volume de 50 microlitres et incuber la plaque 24 heures dans l’hypoxie.
Le lendemain, ajoutez 50 microlitres de concentration différente du médicament testé et ajoutez le même volume de DMEM / F12 uniquement pour déterminer davantage la base de la viabilité cellulaire et incuber la plaque pendant 48 heures supplémentaires. Au troisième jour, reconstituez l’agent et ajoutez 70 microlitres du mélange dans chaque puits. Placez la plaque sur un agitateur orbital pendant 20 minutes, puis mesurez la luminescence.
Ce test est un outil utile pour tester un grand nombre de médicaments afin d’évaluer leurs effets sur la croissance cellulaire du CTC. À Eppendorf, ressuspendez les cellules dans 100 microlitres de PBS pincent la peau à l’arrière de la souris et insèrent l’aiguille sous la peau. Injecter lentement tout le volume au même endroit et surveiller la croissance tumorale tous les deux jours et sacrifier les souris si la tumeur dépassait une taille de 1,5 centimètre cube.
Avant la chirurgie, injecter par voie sous-cutanée un analgésique, à la face dorsale ventrale de la souris, faire une petite incision sous la 10ème côte. Soulevez doucement la rate et posez-la sur une gaze stérile. À l’aide d’une seringue à insuline, injecter 50 microlitres de CTC remis en suspension dans le PBS et attendre trois minutes sans retirer l’aiguille.
Ligaturez le vaisseau artériel d’un côté et le vaisseau vénal de l’autre côté. Ensuite, retirez la rate en coupant directement au-dessus des deux ligatures. Coudre le péritoine abdominal et la peau et bien désinfecter la région.
Le but de cette expérience est de tester la capacité des CTC dérivés d’un patient atteint d’un cancer colorectal à coloniser le foie en induisant une prévoyance métastatique visible. L’isolement et l’établissement de la lignée cellulaire tumorale clinique est un outil émergent pour les études fondamentales et translationnelles. Par exemple, si vous avez un gène d’intérêt où les études in vivo ont démontré que ce gène est impliqué dans la capacité de migration et d’invasion des lignées cellulaires du cancer colorectal, éliminer ce gène dans les lignées cellulaires tumorales circulantes avant l’injection dans la rate de souris, pour les laisser coloniser le foie pourrait être un bon outil pour confirmer votre résultat in vivo.
Pour les études translationnelles, notre principale perspective d’isolement des lignées cellulaires tumorales circulantes est d’utiliser ce précieux matériau en médecine personnalisée. À partir des échantillons de sang des patients, nous isolerions et amplifierions les CTC en culture pendant deux ou trois semaines afin d’avoir suffisamment de matériel pour examiner le panel de médicaments disponibles et évaluer sa cytotoxicité pour finalement attribuer
