Ce protocole décrit une méthode peu coûteuse pour effectuer des tests de viabilité de médicaments à l’aide d’organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes. Les principaux avantages de cette technique sont l’utilisation de matériaux et d’équipements de laboratoire peu coûteux et facilement disponibles. Cette méthode peut être utilisée avant d’entreprendre des dépistages de drogues coûteux à haut débit.
Bien que la méthode consiste à effectuer des tests de viabilité de médicaments dans des organoïdes du cancer de l’ovaire dérivés de patientes, elle peut être appliquée à n’importe quel système organoïde, y compris ceux dérivés de murins. Pour commencer, observez l’extrait de membrane basale ou les organoïdes contenant du BME sous un microscope à fond clair pour assurer une confluence de 70 à 90 %. À l’aide d’une pipette, ajoutez un à deux millilitres de milieu de base préchauffé dans le puits contenant les organoïdes et dissociez mécaniquement les organoïdes en les pipetant de haut en bas.
Transférez l’ensemble de la suspension organoïde dans un tube conique de 15 millilitres et faites vortex le tube pendant cinq à 10 secondes pour désagréger davantage les cellules. Ensuite, centrifugez les cellules à 1,107 G pendant cinq minutes à température ambiante. À l’aide d’une pipette monocanal, aspirer et jeter le surnageant.
Remettre la pastille en suspension dans un millilitre de réactif de dissociation organoïde préchauffé à 37 degrés Celsius et transférer la suspension dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Incubez l’échantillon pendant sept minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, centrifugez le résultat dans une suspension cellulaire à 1,107 G pendant cinq minutes à température ambiante.
Après avoir éliminé le surnageant, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre de milieu de base préchauffé. Reconstituer les cellules dans un mélange de milieux de base et de BME, en maintenant une concentration finale de 20 000 cellules par 10 microlitres. Plaquer une gouttelette de trois microlitres des cellules remises en suspension par puits d’une plaque noire opaque à 96 puits.
Incubez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Enfin, ajoutez 100 microlitres de milieux organoïdes avancés préchauffés dans chaque puits avant d’incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant 24 à 72 heures. Effectuez un traitement médicamenteux des organoïdes deux jours après les avoir plaqués.
Effectuer un test de viabilité sur les organoïdes sept jours après le traitement médicamenteux. Ajoutez 100 microlitres de réactif de test de viabilité dans chaque puits, ce qui porte le volume total à 200 microlitres, et agitez la plaque à 80 tr/min pendant cinq minutes. Laissez ensuite l’assiette incuber à température ambiante pendant 25 minutes supplémentaires.
Pendant ce temps, allumez le lecteur de plaques de bioluminescence et ouvrez le logiciel de contrôle oculaire. Naviguez pour vous connecter à l’instrument"et sélectionnez Infinite 200Pro"Sélectionner la luminescence"et le script par défaut"Ensuite, dans le menu déroulant, choisissez BD 96 FB Falcon BD Falcon 96 Flat Black"comme type de plaque pour définir les paramètres de luminescence. Attribuez l’atténuation à aucune.
Temps d’intégration de 1000 millisecondes et temps de stabilisation de zéro milliseconde. Enfin, découvrez la plaque, chargez-la sur le lecteur de plaque et appuyez sur « start » pour commencer. Des images en fond clair ont été acquises pour les deux organoïdes dérivés du patient, ou PDO, utilisés dans le protocole.
PDO un, dérivé d’une biopsie tumorale et PDO deux dérivé de l’ascite. Les résultats de l’essai de viabilité ont révélé le pourcentage de cellules vivantes dans l’AOP 1 et l’AOP 2 après que les deux aient été traités avec des concentrations variables de carboplatine. Le taux de croissance calculé, ou valeurs GR, a été tracé par rapport aux concentrations de carboplatine correspondantes, et les mesures GR ont révélé que la valeur GR50 pour l’AOP 1 était beaucoup plus élevée que celle pour l’AOP 2.
Cela indiquait que PDO one était plus résistant à la chimiothérapie au platine Lors du placage, il est crucial que la gouttelette de trois microlitres de la suspension cellulaire soit placée directement au centre du puits. Si la gouttelette est placée trop près du bord du puits, elle peut s’effondrer, ce qui affecte les résultats de l’analyse.
