Étude de la calcification de la valve aortique par isolement et culture de lymphocytes T à l’aide de cellules nourricières de Buffy Coat irradié

Ce protocole est facile à exécuter. La phase de clonage permet d’obtenir un plus grand nombre de clones T à partir d’échantillons frais. De plus, le phénotype et la fonction des lymphocytes T peuvent facilement être analysés.

Mary Christopher, une doctorante de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour induire le clonage des lymphocytes T, utilisez la pointe du sac avec la valve sans aiguille pour ouvrir un sac à manteau bouffant irradié dans une hotte à flux laminaire. Transférer jusqu’à 50 millilitres de sang du sac dans une fiole T-150 et ajouter 70 millilitres de PBS à la fiole.

Superposez soigneusement 30 millilitres de sang dilué sur 20 millilitres de gradient de densité dans chacun des quatre tubes coniques de 50 millilitres et séparez les cellules par centrifugation par gradient de densité. Aspirez soigneusement le surnageant et transférez le PBMC de chaque tube dans un seul nouveau tube de 50 millilitres. Utilisez pbS pour porter le volume final à 50 millilitres et collectez le PBMC par centrifugation.

Après un deuxième lavage dans les mêmes conditions, suspendre les cellules d’alimentation isolées dans 10 millilitres de milieu de culture cellulaire pour le comptage, et ajouter 25 millilitres d’un milieu de culture cellulaire de 70 millilitres complété par 50 unités de solution d’IL-2 dans chacun des deux tubes de 50 millilitres. Ajoutez ensuite des cellules nourricières à un tube à une concentration de 2 par 10 à la 6e cellule par millilitre de milieu de culture cellulaire complété par une concentration d’IL-2. Pour mettre en place une culture de lymphocytes T, regrouper le clone de lymphocytes T contenant des surnageants de la fiole d’échantillon de valve sténotique dans un seul tube de 50 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation.

Lavez la pastille trois fois dans 50 millilitres de PBS par lavage, avant de réutiliser les cellules dans 1 millilitre de milieu de culture cellulaire pour le comptage. Diluer les cellules à une concentration de 1 par 10 à la 3ème cellule par millilitre, et ajouter 500 microlitres de cellules au tube du milieu de culture cellulaire complété par IL-2 sans cellules nourricières. Ajouter la suspension de la cellule d’alimentation à une boîte de Petri en plastique de 100 x 15 millilitres et ajouter 100 microlitres de cellules d’alimentation à chaque puits du nombre approprié de plaques de 96 puits à fond en U pour l’expérience.

Ajoutez ensuite les lymphocytes T à une boîte de Pétri et ajoutez 100 microlitres de lymphocytes T à chaque cellule nourricière bien complétée pour une incubation d’une semaine dans l’incubateur de culture cellulaire. L’isolement PBMC est essentiel pour obtenir des cellules nourricières et permettre la détection et la caractérisation des leucocytes infiltrants dans les échantillons de valve aortique. Après deux semaines d’incubation, une population de lymphocytes T clones peut être obtenue.

Ici, le schéma de contrôle pour l’analyse des sous-populations de cellules T chez les patients atteints de maladie valvulaire aortique calcifiante est montré. Comme observé chez ce patient, il y avait plus de lymphocytes T CD4+que de lymphocytes T CD8+. L’analyse cytométrique en flux des lymphocytes T non obstrués confirme que les mêmes marqueurs de lymphocytes T sont présents dans les échantillons de valves natives et de clones.

Prises ensemble, ces données indiquent que les lymphocytes T sont présents dans les valves aortiques calcifiées avec des leucocytes CD45+, ce qui suggère que la maladie de la valve aortique calcifiante est liée à l’activation du système immunitaire et à l’activité inflammatoire. Cette méthode est très polyvalente. Il peut être appliqué à différents protocoles pour lesquels les chercheurs doivent être en mesure d’isoler des cellules d’un tissu, pour la caractérisation fonctionnelle.

Gardez à l’esprit qu’il est important de travailler dans des conditions stériles pour éviter la contamination et d’observer de manière critique les cellules au microscope.