Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Déclaration Ethic: Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Déclaration d&#39;Helsinki et ont été approuvés par le Comité d&#39;éthique clinique à l&#39;Université de Tübingen (38 projets / 2009B02 et 470 / 2013B02). 1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) <ol><li> Prendre 50-100 ml d&#39;un volontaire en bonne santé par ponction veineuse en utilisant une seringue de 50 ml contenant 1000 UI d&#39;héparine et sulfate diluer le sang 1: 2 avec du PBS (pH = 7,2). </li><li> Superposer avec précaution 35 ml de sang: la solution PBS de 15 ml de solution de séparation de sang tels que Biocoll (d = 1,077 g / ml) dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger pendant 15 min à 800 g à RT. REMARQUE: frein ne doit pas être utilisé. </li><li> Recueillir les cellules de la couche lymphocytaire avec une pipette et laver les cellules deux fois dans au moins 50 ml de PBS (centrifugation pendant 12 min; à 400 xg). Eliminer le surnageant après centrifugation avec une pipette. </li><li> Lyse par mise en suspension des erythrocytes restants et IncubCLASSEMENT la fraction lymphocytaire avec 1-5 ml d&#39;une solution tampon hypotonique à 2-4 min. REMARQUE: La durée de l&#39;exposition et de tampon de lyse du volume dépend du tampon de lyse utilisé et de la quantité de globules rouges restant dans la fraction des lymphocytes. </li><li> Diluer les cellules avec du PBS (01:10) et centrifuger à 250 g pendant 12 min et ensuite remettre en suspension et laver le culot de cellules une fois dans 10 ml de PBS à 300 xg pendant 12 min. </li><li> Resuspendre les lymphocytes dans du PBS et compter les cellules dans une chambre de comptage Neubauer en utilisant une solution de bleu trypan. NOTE: Habituellement,&gt; 1 x 10 8 lymphocytes sont reçus à partir de 100 ml fraîchement prélevé le sang périphérique. </li></ol> 2. Isolement des cellules T Vδ1 <ol><li> Prenez &lt;1 x 10 6 lymphocytes isolés pour une première FACS déterminer la fréquence des cellules T CD4 Vδ1. REMARQUE: La taille de la population de cette entité T-cellule peut varier considérablement entre les individus et selon leur état immunologique. Typicallié, environ 1% des cellules T sont Vδ1 + et environ 1-5% de Vδ1 cellules CD4 + sont +. <ol><li> Diluer les cellules avec 1 ml de tampon FACS, qui se compose de PBS contenant 2% de FCS et 5 mM d&#39;EDTA. Centrifuger à 660 g pendant 2 min et décanter le surnageant. Le volume de reflux du tampon FACS environ 100 ul est suffisante pour la coloration ultérieure. Brièvement vortex et on incube les cellules avec 5 ul de réactif de blocage de Fc pendant 5 min à température ambiante pour augmenter la spécificité de la coloration FACS. </li><li> Ajouter des anticorps monoclonaux humains directement aux cellules sans enlever le réactif de blocage de Fc. Assurez-vous de colorer les cellules avec des anticorps contre Vδ1 (01h50), CD3 (01h50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) et TCRaß (1:25). Préparer le contrôle isotypique avec les isotypes d&#39;immunoglobulines correspondantes. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules dans 1 ml de tampon FACS (centrifuger 2 min; à 660 xg), décanter le Supernatant et procéder à l&#39;acquisition par FACS dans le volume de tampon restant. </li></ol></li><li> Pastiller les cellules (qui ne sont pas utilisées dans l&#39;analyse FACS) par centrifugation pendant 12 min; à 300 g; 8 ° C. Retirez le surnageant et remettre la cellule pelletin 60 pi MACS-tampon par 1 x 10 7 cellules. Ajouter 20 ul de réactif de Fc-blocage par 1 x 10 7 cellules et incuber pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;anticorps anti-humain Vδ1 conjugué au FITC pour 1 x 10 7 cellules directement aux cellules. Incuber pendant 12 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules en utilisant 14 ml MACS-tampon (centrifugeuse pendant 12 min; à 300 g; 8 ° C). Rejeter le surnageant complètement et remettre les cellules dans 80 ul MACS tampon par 1x10 7 cellules. </li><li> Prendre 1-2 x 10 5 cellules et les diluer dans du tampon FACS 100 ul pour la vérification de l&#39;étiquetage par analyse FACS. Pas d&#39;autres additifs sont nécessaires pour cette étape. Assurez-vous qu&#39;il ya un suffidifférence de sante dans la luminosité pour Vδ1 - et les cellules Vδ1 +. Si cela est pas le cas, répétez les étapes 2.3) et 2.4). </li><li> Ajouter 20 ul microbilles anti-FITC par 1 x 10 7 cellules pour les cellules restantes, bien mélanger et laisser incuber pendant 15 minutes dans l&#39;obscurité à 4 ° C. Par la suite, laver les cellules à l&#39;aide d&#39;au moins 10 ml de tampon MACS (centrifugeuse pendant 12 min, à 300 g; 8 ° C). </li><li> Au cours de la centrifugation, équilibrer la colonne magnétique pré-refroidi placé dans un aimant avec un tampon MACS 500 ul. </li><li> Reprendre les cellules dans 500 pi MACS-tampon (pour le nombre de cellules supérieure à 1 x 10 8, intensifier ce volume en conséquence) et appliquer soigneusement les cellules sur la colonne. Recueillir l&#39;écoulement contenant le Vδ1 - cellules. </li><li> Laver la colonne trois fois avec 500 ul MACS-tampon et de recueillir à nouveau l&#39;écoulement dans le même tube. Notez que le réservoir doit être vide avant d&#39;appliquer le tampon sur la colonne. </li><li> Retirer la colonne du dispositif magnétique et le placer dans un tube conique de 15 ml. Rincer rapidement la colonne avec 1 ml de tampon MACS en poussant fermement le piston dans la colonne. Recueillir l&#39;éluat dans un tube. NOTE: Pour obtenir une pureté de&gt; 98%, il est généralement nécessaire de répéter les étapes 2.7 à 2.9) avec une seconde colonne. </li><li> Vérifier la pureté des cellules par analyse FACS 18 avec le même panneau anticorps comme avant (voir 2.1.2) et de compter les cellules. </li></ol> 3. Isolement de cellules T + Vδ1CD4 <ol><li> Reprendre 25 ul de billes CD4 avec un vortex pendant&gt; 30 sec. Laver les billes (le montant minimum tel que représenté par le fabricant) dans 1 ml de tampon MACS dans un tube de 1,5 ml de réaction en plaçant le tube dans un aimant pendant 1 min. Jeter le surnageant soigneusement avec une pipette à petite échelle (200 ul) et remettre en suspension les billes dans le volume initial de tampon MACS-. </li><li> Pelletiser Vδ1 + cellules (centrifugeuse pour 12 min; à 300 g) et aspirer le surnageant et remettre tous les Vδ1 + cellules dans 500 ul MACS-tampon et ajoutez-les au tube contenant les billes. Mélanger vigoureusement et incuber pendant 20 min à 4 ° C avec basculement constant (par exemple, dans un dispositif de rotation). </li><li> Placer le tube contenant les cellules dans un aimant pendant 2 min. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas des restes dans le couvercle. NOTE: les cellules CD4 + ont lié les sera des billes magnétiques et attacher sur le côté du tube tournée vers l&#39;aimant. </li><li> Ouvrez avec précaution le couvercle tout en gardant le tube à l&#39;intérieur du dispositif magnétique et recueillir le surnageant qui contient le CD4 - Vδ1 cellules + aide d&#39;une pipette à petite échelle. Placez CD4 + - Vδ1 cellules dans un tube séparé et placer ce tube dans l&#39;aimant à nouveau pour éviter restant éventuellement cellules CD4 ou des perles de la population. <ol><li> Laver le CD4 - cellules dans 5 ml MACS-tampon (centrifugeuse pendant 12 min; à 300 g) unnd remettre en suspension à une concentration de 1 x 10 5 cellules par 100 pi de médias. CD4 - cellules peuvent être facilement cultivées dans les conditions indiquées ci-dessous (4,2). </li></ol></li><li> Placer le tube avec les objectifs de cellules CD4 + à l&#39;extérieur du champ magnétique, remettre les cellules dans 500 pi MACS-tampon et les remettre dans le dispositif magnétique. Répétez les étapes 3,3-3,5 deux fois pour obtenir une plus grande pureté. Retirer le surnageant par pipetage </li><li> Resuspendre les cellules CD4 + dans 100 ul de milieu de culture (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine) et ajouter 10 ul d&#39;une solution de détachement en forme de bourrelet. Incuber à température ambiante pendant 45 min avec inclinaison constante (par exemple, dans un dispositif de rotation). </li><li> Placer les cellules dans un aimant pendant 1 min. Recueillir soigneusement le surnageant contenant des cellules CD4 + + Vδ1 libre-talon aide d&#39;une pipette à petite échelle. </li><li> En dehors de l&#39;aimant, remettre en suspension les perles avec 100 pi milieux de culture et de répétitionétapes 3.6 et 3.7 à deux reprises pour obtenir des numéros de cellulaires plus élevées de cellules CD4 +. </li><li> Pastiller les cellules (centrifuger à 300 g, 12 min) et jeter le surnageant par pipetage complètement. Reprendre les cellules dans les médias, préchauffées fraîches et les compter. Examiner la pureté des Vδ1 + CD4 + par analyse FACS représentées dans les étapes 2.1.1-2.1.3. </li></ol> 4. unicellulaire clonage par dilution limitée <ol><li> Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant d&#39;un donneur allogénique comme représenté sur 1/1 à 1/6. </li><li> Irradier 2,5 x 10 7 PBMC allogéniques avec 80 Gy en 25 ml de milieu de culture en utilisant γ-rayonnement. </li><li> Ajouter IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) et PHA (2 pg / ml) aux cellules nourricières irradiées et les distribuer dans des plaques à 96 puits en forme de U, 5 x 10 4 chargeur cellules dans 50 ul par puits. </li><li> Diluer les cellules CD4 + + Vδ1 à une concentration de 0,3 cellules par 50 ul. Pipette 50 ul de la solution de cellules dans chaque puits et les cellules hébergeant les cytokines irradiés. REMARQUE: Ainsi, les cytokines sont dilués à la concentration finale de 100 U / ml d&#39;IL-2, 10 ng / ml d&#39;IL-7 et 1 ug / ml de PHA. Incuber les plaques à 96 puits dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 atmosphère humidifiée. <ol><li> Eventuellement, de cultiver restant purifié Vδ1 + cellules CD4 + que la culture en vrac dans les mêmes conditions de culture que les clones. </li></ol></li><li> Fournir les cellules tous les 3-4 jours avec des cytokines et des milieux frais. Pour cela, l&#39;échange de la moitié de la moyenne dans les puits avec 50 pi de milieu frais par pipetage. Ajouter concentration deux fois plus de cytokines pour tous les supplémentation. Ajouter 5x10 4 cellules nourricières irradiées par puits toutes les autres manches de l&#39;alimentation. </li><li> En utilisant un microscope, observer premiers clones deviennent visibles au bout de 3-4 semaines, car ils métabolisent et donc changer la couleur des colonies de milieu de culture et forme. NOTE: Pour la fourrureTher culture, remettre en suspension les clones bien et les transférer pour séparer des plaques à 96 puits. Analyser les cellules par FACS comme indiqué dans 2.1.1-2.1.3. Clones maintenu dans ces conditions peuvent éventuellement changer leur TCR de Vδ1 à αβTCR. Le point de temps pour cette transdifférenciation varie de clone pour cloner. </li></ol>

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Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).</li><li>Maillard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch-dependent+T-lineage+commitment+occurs+at+extrathymic+sites+following+bone+marrow+transplantation.">Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation.</a> Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).</li><li>Ziegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Peripheral+CD4(+)+Vdelta1(+)+gammadeltaT+Cells+Can+Develop+into+alphabetaT+Cells.">Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells.</a> Front Immunol. 5, 645 (2014).</li><li>Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+simulations+of+the+energy+dissipation+rate+in+a+fluorescence-activated+cell+sorter:+Implications+to+cells.">Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Pour étudier le phénotype, la biologie et la fonction d&#39;une entité de cellules rares (T), à savoir les cellules Vδ1 + T CD4 +, nous avons utilisé deux marqueurs: Vδ1 et CD4 pour son isolement cellulaire magnétique positive. Vδ1 est un récepteur orphelin, alors que CD4 est exprimé sur les lymphocytes T auxiliaires, à un niveau inférieur sur les monocytes et les cellules dendritiques, et à un niveau très faible sur les cellules progénitrices hématopoïétiques. ...

Chez les vertébrés, l&#39;immunité adaptative qui est structuré dans le cellulaire et une partie de l&#39;immunité humorale joue un rôle majeur dans la défense contre les pathogènes. La reconnaissance d&#39;une large gamme d&#39;antigènes est médiée par hyperpolymorphic T et B des récepteurs de cellules (TCR / BCR), qui en ce qui concerne les cellules T sont supposés être produite principalement dans le thymus 1. Celui-ci, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), dérivées de moelle osseuse, le thymus semences et de différencier le long étapes bien définies finalement donné lieu à toutes les lignées de cellules T. Thymus progéniteurs ensemencement sont CD4 - et CD8 - et constituent donc la immature, double négatif (DN) fraction de thymocytes. Thymus signaux dérivés induisent alors leur engagement lignée et de la différenciation en soit des cellules T aß ou yô. L&#39;expression de TCR-y et TCR-ô gènes de chaîne fonctionnellement réarrangés en DN2 / 3 thymocytes conduit à y δTCR complexes, qui entraînent une de prolifération cellulaireD promouvoir la différenciation en cellules γ de 2,3 AT. En revanche, le réarrangement d&#39;une chaîne TCR-β fonctionnel, qui peut coupler avec preTα de construire un preTCR pT, induit la réduction au silence de la transcription de la chaîne TCR-γ dans les thymocytes DN3 et leur transition dans les thymocytes CD4 + CD8 + double-positifs 4 . A ce stade, la recombinaison de la chaîne TCR-α se produit, la suppression du locus TCR-δ qui se niche dans le locus TCR-α, abrogeant ainsi la production d&#39;un γδTCR dans ces cellules irrévocablement 5-9. ΑβTCRs réarrangés sont ensuite sélectionnés pour leur capacité à se lier auto-MHC faiblement (sélection positive), qui ne peut dépasser un certain seuil pour éviter l&#39;auto-immunité (sélection négative). Selon leur capacité de liaison I ou II du CMH de classe, les cellules αβT sélectionnés développer en cellules simple positif CD4 + ou T CD8 +, qui sortent du thymus lymphocytes T naïfs que. Cependant, l&#39;involution du thymus commence tôt dans la vie conduisant à exponentiellement réduit la production de cellules T naïves qui est presque éteinte post-adolescence 10. Néanmoins, la taille du pool de cellules T reste constante tout au long de la vie, qui peut être expliqué en partie seulement par une prolifération homéostatique post-thymique des lymphocytes T et la prolifération de long vécu mémoire immunologique 11. Par conséquent, le développement de cellules T extrathymique doit se produire. Des recherches récentes ont gagné activité importante qui a caractérisé progéniteurs des cellules αβT, qui au-extrathymique sites à donné lieu à aß fonctionnelle des cellules T 12-17. Pourtant, les connaissances détaillées sur extrathymique précurseurs de cellules que αβT indépendant d&#39;un thymus se différencier en cellules αβT est aussi fragmentaire que le fond que nous avons sur la route qu&#39;ils prennent de ce fait. Nous avons récemment identifié la petite entité T-cellule de Vδ1 + </sup&gt; cellules CD4 + γδT comme une cellule prognitor αβT extrathymique 18, qui, lorsqu&#39;il est isolé à partir du sang périphérique de donneurs humains en bonne santé peut transdifférencier dans les cellules αβT dans un environnement inflammatoire doux. Il est intéressant et contraire à la prolifération homéostatique des lymphocytes T post-thymiques, transdifférenciation des Vδ1 cellules CD4 + génère de nouveaux récepteurs de cellules T, élargissant ainsi la diversité du répertoire, de sorte que potentiellement de nouveaux antigènes peuvent être reconnus et peut protéger l&#39;hôte contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Cela ajoute à la plasticité des cellules T et ajoute une nouvelle voie jusqu&#39;ici incompris pour le développement de cellules T extrathymique. L&#39;isolement quantitative à partir de sources lymphocytaires, la génération de clones unicellulaires et leur expansion efficace sont essentiels pour l&#39;objectif d&#39;identifier les marqueurs et des molécules qui déclenchent cette cellule αβT precursor`s développement extrathymique.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="789">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biocoll Solution</td>
			<td style="width:93px;">Biochrom</td>
			<td style="width:119px;">L 6113</td>
			<td style="width:361px;">lymphocyte separating solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lysing Buffer</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555899</td>
			<td>lysis of erythrocytes&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate-buffered Saline</td>
			<td style="width:93px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MACS buffer</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>supplement with BSA and pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BSA</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human Vd1 FITC (clone:&#160; TS8.2)</td>
			<td style="width:93px;">Thermo Scientific</td>
			<td>TCR2730</td>
			<td>not mandatorily from this supplier</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>345766</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>555548</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&#160;</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-097-333</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td>
			<td style="width:93px;">BD BioSciences</td>
			<td>641400</td>
			<td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Anti-FITC MultiSort Kit</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-058-701</td>
			<td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS columns</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:119px;">130-042-201</td>
			<td>pre-cool before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">MiniMACS Separator</td>
			<td style="width:93px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CD4 Positive Isolation Kit</td>
			<td style="width:93px;">life technologies</td>
			<td>11331D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Le thymus, l&#39;organe primaire pour la génération de cellules T aß et épine dorsale du système immunitaire adaptative chez les vertébrés, a longtemps été considérée comme la seule source de cellules αβT. Pourtant, involution thymique commence tôt dans la vie conduisant à une sortie considérablement réduit de cellules αβT naïfs dans la périphérie. Néanmoins, même les centenaires peuvent construire l&#39;immunité contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Des recherches récentes suggèrent le développement des cellules αβT extrathymique, mais notre compréhension des voies qui peuvent compenser la perte de la fonction thymique sont encore rudimentaire. cellules γδ T sont des lymphocytes innées qui constituent le principal sous-ensemble de cellules T dans les tissus. Nous avons récemment attribué une fonction exceptionnelle jusqu&#39;ici incompris à un sous-ensemble de cellules T de γδ en montrant que l&#39;entité rare de CD4 + Vδ1 + γδ cellules T peuvent transdifférencier dans les cellules αβT dans des conditions inflammatoires. Ici, nous pournir le protocole pour l&#39;isolement de cette ancêtre du sang périphérique et sa culture subséquente. Vδ1 cellules sont positivement enrichis à partir de PBMC de donneurs humains en bonne santé en utilisant des billes magnétiques, suivie d&#39;une deuxième étape dans laquelle nous ciblons la fraction rares des cellules CD4 + avec une technique de marquage magnétique plus loin. La force magnétique de la deuxième étiquetage dépasse celui de la première étiquette magnétique, et permet ainsi l&#39;isolement positif efficace, quantitative et spécifique de la population d&#39;intérêt. On introduit ensuite l&#39;état de la technique et de la culture requise pour le clonage et efficacement l&#39;expansion des cellules et pour l&#39;identification des clones générés par analyse FACS. Ainsi, nous fournissons un protocole détaillé pour la purification, de la culture et de l&#39;expansion ex vivo de cellules CD4 + Vδ1 + yô Les cellules T. Cette connaissance est une condition préalable pour des études qui se rapportent à cette αβT progenitor`s de biologie cellulaire et pour ceux qui visent à IDEntifier les déclencheurs moléculaires qui sont impliqués dans son transdifférenciation.

La figure 1 illustre les différentes étapes et les résultats de l&#39;isolement de cellules T Vδ1 partir de sang périphérique. La figure 1A montre une distribution typique de Vδ1 cellules CD3 + dans les lymphocytes +, ainsi que la co-expression du récepteur de la population Vδ1 +. Dans ce donneur, la fréquence des cellules Vδ1 + (rouge) est de 2,3% du nombre total de lymphocytes CD4 et l&#39;expression (vert) de Vδ1 + ly...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&amp;#948;1+CD4+&amp;#947;&amp;#948; T Cells, an Extrathymic &amp;#945;&amp;#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.2K vues.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Vidéo: Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

Human T isolement des lymphocytes, de la Culture et de l&#39;analyse des migrations In Vitro</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

Recherche

Immunologie et infection

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide complete protection against the development or recurrence of breast cancer. To overcome this problem by increasing the frequency of tumor-reactive T cells, adoptive immunotherapy has been employed. A variety of protocols have been used for the expansion of tumor-specific T cells. These protocols, however, are restricted to the use of tumor antigens ex vivo for the activation of antigen-specific T cells. Very recently, common gamma chain cytokines such as IL-2, IL-7, IL-15, and IL-21 have been used alone or in combination for the enhancement of anti-tumor immune responses3. However, it is not clear what formulation would work best for the expansion of tumor-reactive T cells. Here we present a protocol for the selective activation and expansion of tumor-reactive T cells from the FVBN202 transgenic mouse model of HER-2/neu positive breast carcinoma for use in adoptive T cell therapy of breast cancer. The protocol includes activation of T cells with bryostatin-1/ionomycin (B/I) and IL-2 in the absence of tumor antigens for 16 hours. B/I activation mimics intracellular signals that result in T cell activation by increasing protein kinase C activity and intracellular calcium, respectively4. This protocol specifically activates tumor-specific T cells while killing irrelevant T cells. The B/I-activated T cells are cultured with IL-7 and IL-15 for 24 hours and then pulsed with IL-2. After 24 hours, T cells are washed, split, and cultured with IL-7 + IL-15 for additional 4 days. Tumor-specificity and anti-tumor efficacy of the ex vivo expanded T cells is determined.

Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation

An efficient protocol for the ex vivo expansion of tumor-reactive T cells from tumor-draining lymph nodes or other secondary lymphoid tissues of tumor-bearing hosts is described. This protocol selectively expands tumor-specific T cells for use in adoptive immunotherapy of breast cancer.

Expansion ex vivo des cellules tumorales T-réactive par le moyen de 1/Ionomycin Bryostatine et la chaîne gamma commune cytokines Formulation

It was reported that breast cancer patients have pre-existing immune responses against their tumors1,2. However, such immune responses fail to provide ...

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration of T cells into lymph nodes is a complex process which involves both cellular and chemical factors including chemokines. Recently, the use of two-photon microscopy has permitted to track T cells in intact lymph nodes and to derive some quantitative information on their behavior and their interactions with other cells. While there are obvious advantages to an in vivo system, this approach requires a complex and expensive instrumentation and provides limited access to the tissue. To analyze the behavior of T cells within murine lymph nodes, we have developed a slice assay 
1, originally set up by neurobiologists and transposed recently to murine thymus 2. In this technique, fluorescently labeled T cells are plated on top of an acutely prepared lymph node slice. In this video-article, the localization and migration of T cells into the tissue are analyzed in real-time with a widefield and a confocal microscope. The technique which complements in vivo two-photon microscopy offers an effective approach to image T cells in their natural environment and to elucidate mechanisms underlying T cell migration.

Ex vivo Imaging of T Cells in Murine Lymph Node Slices with Widefield and Confocal Microscopes

This protocol describes a method to image fluorescent T cells introduced into lymph node slices. The technique permits real-time analyses of T cell migration with traditional widefield fluorescence or confocal microscopes.

Ex vivo l&#39;imagerie de cellules T dans murin tranches avec des ganglions lymphatiques et la microscopie confocale Widefield

Na&iuml;ve T cells continuously traffic to secondary lymphoid organs, including peripheral lymph nodes, to detect rare expressed antigens. The migration ...

Isolation of Double Negative &#945;&#946; T Cells from the Kidney

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in various immune responses. DN T cells are a unique immune cell type that has been implicated in regulating immune and autoimmune responses and tolerance to allotransplants1-6. DN T cells are, however, rare in peripheral blood and secondary lymphoid organs (spleen and lymph nodes), but are major residents of the normal kidney. Very little is known about their pathophysiologic function7 due to their paucity in the periphery. We recently described a comprehensive phenotypic and functional analysis of this population in the kidney8 in steady state and during ischemia reperfusion injury. Analysis of DN T cell function will be greatly enhanced by developing a protocol for their isolation from the kidney.
Here, we describe a novel protocol that allows isolation of highly pure ab CD4+ CD8+ T cells and DN T cells from the murine kidney. Briefly, we digest kidney tissue using collagenase and isolate kidney mononuclear cells (KMNC) by density gradient. This is followed by two steps to enrich hematopoietic T cells from 3% to 70% from KMNC. The first step consists of a positive selection of hematopoietic cells using a CD45+ isolation kit. In the second step, DN T cells are negatively isolated by removal of non-desired cells using CD4, CD8, and MHC class II monoclonal antibodies and CD1d &#945;-galcer tetramer. This strategy leads to a population of more than 90% pure DN T cells. Surface staining with the above mentioned antibodies followed by FACs analysis is used to confirm purity.

Isolation of Double Negative &amp;#945;&amp;#946; T Cells from the Kidney

DNabT cells are rare among peripheral T cells; however, they are abundant in certain non-lymphoid tissues. Difficulty of isolating DN T cells from non-lymphoid tissue hinders their functional analysis despite increasing recognized pathophysiologic significance. We describe a novel protocol for isolation of highly purified DN T cells from murine kidney.

Isolation de Double Negative αβ cellules T du rein

There is currently no standard protocol for the isolation of DN T cells from the non-lymphoid tissues despite their increasingly reported involvement in ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the protocols described here use freshly isolated human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or plasmacytoid dendritic cells (pDCs) to sense infections in either T cell line (MT4) or heterologous primary CD4+ T cells. In order to ensure proper sensing, it is essential that PBMC are isolated immediately after blood collection and that optimal percentage of infected T cells are used. Furthermore, multi-parametric flow cytometric staining can be used to confirm that PBMC samples contain the different cell lineages at physiological ratios. A number of controls can also be included to evaluate viability and functionality of pDCs. These include, the presence of specific surface markers, assessing cellular responses to known agonist of Toll-Like Receptors (TLR) pathways, and confirming a lack of spontaneous type-I interferon (IFN) production. In this system, freshly isolated PBMCs or pDCs are co-cultured with HIV-1 infected cells in 96 well plates for 18-22 hr. Supernatants from these co-cultures are then used to determine the levels of bioactive type-I IFNs by monitoring the activation of the ISGF3 pathway in HEK-Blue IFN-&#945;/&#946; cells. Prior and during co-culture conditions, target cells can be subjected to flow cytometric analysis to determine a number of parameters, including the percentage of infected cells, levels of specific surface markers, and differential killing of infected cells. Although, these protocols were initially developed to follow type-I IFN production, they could potentially be used to study other imuno-modulatory molecules released from pDCs and to gain further insight into the molecular mechanisms governing HIV-1 innate sensing.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Unlike cell-free HIV-1 particles, infected CD4+ T cells are effectively sensed by plasmacytoid dendritic cells (pDCs). This manuscript describes a method where peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or isolated pDCs are co-cultured with HIV-1 infected T cells to evaluate innate sensing by pDCs as assessed by release of type-I IFN.

L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle de T-Cell Attaque de Oligodendrocyte dirigée dans aigus tranches cérébrales

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture cellulaire

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

le<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture et Pattern Recognition Receptor Stimulation de la souris Intestinal organites

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modèle de Culture primaire de cellules bursite de poulet Ex Vivo pour étudier la bursite infectieuse Virus pathogenèse

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...