Name: isolation and ex vivo culture of vδ1+cd4+γδ t cells, an extrathymic αβt-cell progenitor
Uploaded: 2015-12-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Ex Vivo Culture of VÃŽÂ´1+CD4+ÃŽÂ³ÃŽÂ´ T Cells, an Extrathymic ÃŽÂ±ÃŽÂ²T-cell Progenitor at JoVE.com

Christian Welker is funded by a grant provided by the J&#252;rgen-Manchot-Stiftung.

Déclaration Ethic: Toutes les procédures ont été effectuées conformément à la Déclaration d&#39;Helsinki et ont été approuvés par le Comité d&#39;éthique clinique à l&#39;Université de Tübingen (38 projets / 2009B02 et 470 / 2013B02). 1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) <ol><li> Prendre 50-100 ml d&#39;un volontaire en bonne santé par ponction veineuse en utilisant une seringue de 50 ml contenant 1000 UI d&#39;héparine et sulfate diluer le sang 1: 2 avec du PBS (pH = 7,2). </li><li> Superposer avec précaution 35 ml de sang: la solution PBS de 15 ml de solution de séparation de sang tels que Biocoll (d = 1,077 g / ml) dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger pendant 15 min à 800 g à RT. REMARQUE: frein ne doit pas être utilisé. </li><li> Recueillir les cellules de la couche lymphocytaire avec une pipette et laver les cellules deux fois dans au moins 50 ml de PBS (centrifugation pendant 12 min; à 400 xg). Eliminer le surnageant après centrifugation avec une pipette. </li><li> Lyse par mise en suspension des erythrocytes restants et IncubCLASSEMENT la fraction lymphocytaire avec 1-5 ml d&#39;une solution tampon hypotonique à 2-4 min. REMARQUE: La durée de l&#39;exposition et de tampon de lyse du volume dépend du tampon de lyse utilisé et de la quantité de globules rouges restant dans la fraction des lymphocytes. </li><li> Diluer les cellules avec du PBS (01:10) et centrifuger à 250 g pendant 12 min et ensuite remettre en suspension et laver le culot de cellules une fois dans 10 ml de PBS à 300 xg pendant 12 min. </li><li> Resuspendre les lymphocytes dans du PBS et compter les cellules dans une chambre de comptage Neubauer en utilisant une solution de bleu trypan. NOTE: Habituellement,&gt; 1 x 10 8 lymphocytes sont reçus à partir de 100 ml fraîchement prélevé le sang périphérique. </li></ol> 2. Isolement des cellules T Vδ1 <ol><li> Prenez &lt;1 x 10 6 lymphocytes isolés pour une première FACS déterminer la fréquence des cellules T CD4 Vδ1. REMARQUE: La taille de la population de cette entité T-cellule peut varier considérablement entre les individus et selon leur état immunologique. Typicallié, environ 1% des cellules T sont Vδ1 + et environ 1-5% de Vδ1 cellules CD4 + sont +. <ol><li> Diluer les cellules avec 1 ml de tampon FACS, qui se compose de PBS contenant 2% de FCS et 5 mM d&#39;EDTA. Centrifuger à 660 g pendant 2 min et décanter le surnageant. Le volume de reflux du tampon FACS environ 100 ul est suffisante pour la coloration ultérieure. Brièvement vortex et on incube les cellules avec 5 ul de réactif de blocage de Fc pendant 5 min à température ambiante pour augmenter la spécificité de la coloration FACS. </li><li> Ajouter des anticorps monoclonaux humains directement aux cellules sans enlever le réactif de blocage de Fc. Assurez-vous de colorer les cellules avec des anticorps contre Vδ1 (01h50), CD3 (01h50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) et TCRaß (1:25). Préparer le contrôle isotypique avec les isotypes d&#39;immunoglobulines correspondantes. Incuber les cellules avec des anticorps pendant 20 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules dans 1 ml de tampon FACS (centrifuger 2 min; à 660 xg), décanter le Supernatant et procéder à l&#39;acquisition par FACS dans le volume de tampon restant. </li></ol></li><li> Pastiller les cellules (qui ne sont pas utilisées dans l&#39;analyse FACS) par centrifugation pendant 12 min; à 300 g; 8 ° C. Retirez le surnageant et remettre la cellule pelletin 60 pi MACS-tampon par 1 x 10 7 cellules. Ajouter 20 ul de réactif de Fc-blocage par 1 x 10 7 cellules et incuber pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 10 ul d&#39;anticorps anti-humain Vδ1 conjugué au FITC pour 1 x 10 7 cellules directement aux cellules. Incuber pendant 12 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver les cellules en utilisant 14 ml MACS-tampon (centrifugeuse pendant 12 min; à 300 g; 8 ° C). Rejeter le surnageant complètement et remettre les cellules dans 80 ul MACS tampon par 1x10 7 cellules. </li><li> Prendre 1-2 x 10 5 cellules et les diluer dans du tampon FACS 100 ul pour la vérification de l&#39;étiquetage par analyse FACS. Pas d&#39;autres additifs sont nécessaires pour cette étape. Assurez-vous qu&#39;il ya un suffidifférence de sante dans la luminosité pour Vδ1 - et les cellules Vδ1 +. Si cela est pas le cas, répétez les étapes 2.3) et 2.4). </li><li> Ajouter 20 ul microbilles anti-FITC par 1 x 10 7 cellules pour les cellules restantes, bien mélanger et laisser incuber pendant 15 minutes dans l&#39;obscurité à 4 ° C. Par la suite, laver les cellules à l&#39;aide d&#39;au moins 10 ml de tampon MACS (centrifugeuse pendant 12 min, à 300 g; 8 ° C). </li><li> Au cours de la centrifugation, équilibrer la colonne magnétique pré-refroidi placé dans un aimant avec un tampon MACS 500 ul. </li><li> Reprendre les cellules dans 500 pi MACS-tampon (pour le nombre de cellules supérieure à 1 x 10 8, intensifier ce volume en conséquence) et appliquer soigneusement les cellules sur la colonne. Recueillir l&#39;écoulement contenant le Vδ1 - cellules. </li><li> Laver la colonne trois fois avec 500 ul MACS-tampon et de recueillir à nouveau l&#39;écoulement dans le même tube. Notez que le réservoir doit être vide avant d&#39;appliquer le tampon sur la colonne. </li><li> Retirer la colonne du dispositif magnétique et le placer dans un tube conique de 15 ml. Rincer rapidement la colonne avec 1 ml de tampon MACS en poussant fermement le piston dans la colonne. Recueillir l&#39;éluat dans un tube. NOTE: Pour obtenir une pureté de&gt; 98%, il est généralement nécessaire de répéter les étapes 2.7 à 2.9) avec une seconde colonne. </li><li> Vérifier la pureté des cellules par analyse FACS 18 avec le même panneau anticorps comme avant (voir 2.1.2) et de compter les cellules. </li></ol> 3. Isolement de cellules T + Vδ1CD4 <ol><li> Reprendre 25 ul de billes CD4 avec un vortex pendant&gt; 30 sec. Laver les billes (le montant minimum tel que représenté par le fabricant) dans 1 ml de tampon MACS dans un tube de 1,5 ml de réaction en plaçant le tube dans un aimant pendant 1 min. Jeter le surnageant soigneusement avec une pipette à petite échelle (200 ul) et remettre en suspension les billes dans le volume initial de tampon MACS-. </li><li> Pelletiser Vδ1 + cellules (centrifugeuse pour 12 min; à 300 g) et aspirer le surnageant et remettre tous les Vδ1 + cellules dans 500 ul MACS-tampon et ajoutez-les au tube contenant les billes. Mélanger vigoureusement et incuber pendant 20 min à 4 ° C avec basculement constant (par exemple, dans un dispositif de rotation). </li><li> Placer le tube contenant les cellules dans un aimant pendant 2 min. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas des restes dans le couvercle. NOTE: les cellules CD4 + ont lié les sera des billes magnétiques et attacher sur le côté du tube tournée vers l&#39;aimant. </li><li> Ouvrez avec précaution le couvercle tout en gardant le tube à l&#39;intérieur du dispositif magnétique et recueillir le surnageant qui contient le CD4 - Vδ1 cellules + aide d&#39;une pipette à petite échelle. Placez CD4 + - Vδ1 cellules dans un tube séparé et placer ce tube dans l&#39;aimant à nouveau pour éviter restant éventuellement cellules CD4 ou des perles de la population. <ol><li> Laver le CD4 - cellules dans 5 ml MACS-tampon (centrifugeuse pendant 12 min; à 300 g) unnd remettre en suspension à une concentration de 1 x 10 5 cellules par 100 pi de médias. CD4 - cellules peuvent être facilement cultivées dans les conditions indiquées ci-dessous (4,2). </li></ol></li><li> Placer le tube avec les objectifs de cellules CD4 + à l&#39;extérieur du champ magnétique, remettre les cellules dans 500 pi MACS-tampon et les remettre dans le dispositif magnétique. Répétez les étapes 3,3-3,5 deux fois pour obtenir une plus grande pureté. Retirer le surnageant par pipetage </li><li> Resuspendre les cellules CD4 + dans 100 ul de milieu de culture (RPMI 1640, 10% de FCS, 1% de L-glutamine, 1% de pénicilline / streptomycine) et ajouter 10 ul d&#39;une solution de détachement en forme de bourrelet. Incuber à température ambiante pendant 45 min avec inclinaison constante (par exemple, dans un dispositif de rotation). </li><li> Placer les cellules dans un aimant pendant 1 min. Recueillir soigneusement le surnageant contenant des cellules CD4 + + Vδ1 libre-talon aide d&#39;une pipette à petite échelle. </li><li> En dehors de l&#39;aimant, remettre en suspension les perles avec 100 pi milieux de culture et de répétitionétapes 3.6 et 3.7 à deux reprises pour obtenir des numéros de cellulaires plus élevées de cellules CD4 +. </li><li> Pastiller les cellules (centrifuger à 300 g, 12 min) et jeter le surnageant par pipetage complètement. Reprendre les cellules dans les médias, préchauffées fraîches et les compter. Examiner la pureté des Vδ1 + CD4 + par analyse FACS représentées dans les étapes 2.1.1-2.1.3. </li></ol> 4. unicellulaire clonage par dilution limitée <ol><li> Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) provenant d&#39;un donneur allogénique comme représenté sur 1/1 à 1/6. </li><li> Irradier 2,5 x 10 7 PBMC allogéniques avec 80 Gy en 25 ml de milieu de culture en utilisant γ-rayonnement. </li><li> Ajouter IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) et PHA (2 pg / ml) aux cellules nourricières irradiées et les distribuer dans des plaques à 96 puits en forme de U, 5 x 10 4 chargeur cellules dans 50 ul par puits. </li><li> Diluer les cellules CD4 + + Vδ1 à une concentration de 0,3 cellules par 50 ul. Pipette 50 ul de la solution de cellules dans chaque puits et les cellules hébergeant les cytokines irradiés. REMARQUE: Ainsi, les cytokines sont dilués à la concentration finale de 100 U / ml d&#39;IL-2, 10 ng / ml d&#39;IL-7 et 1 ug / ml de PHA. Incuber les plaques à 96 puits dans un incubateur à 37 ° C, 5% CO 2 atmosphère humidifiée. <ol><li> Eventuellement, de cultiver restant purifié Vδ1 + cellules CD4 + que la culture en vrac dans les mêmes conditions de culture que les clones. </li></ol></li><li> Fournir les cellules tous les 3-4 jours avec des cytokines et des milieux frais. Pour cela, l&#39;échange de la moitié de la moyenne dans les puits avec 50 pi de milieu frais par pipetage. Ajouter concentration deux fois plus de cytokines pour tous les supplémentation. Ajouter 5x10 4 cellules nourricières irradiées par puits toutes les autres manches de l&#39;alimentation. </li><li> En utilisant un microscope, observer premiers clones deviennent visibles au bout de 3-4 semaines, car ils métabolisent et donc changer la couleur des colonies de milieu de culture et forme. NOTE: Pour la fourrureTher culture, remettre en suspension les clones bien et les transférer pour séparer des plaques à 96 puits. Analyser les cellules par FACS comme indiqué dans 2.1.1-2.1.3. Clones maintenu dans ces conditions peuvent éventuellement changer leur TCR de Vδ1 à αβTCR. Le point de temps pour cette transdifférenciation varie de clone pour cloner. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Pour étudier le phénotype, la biologie et la fonction d&#39;une entité de cellules rares (T), à savoir les cellules Vδ1 + T CD4 +, nous avons utilisé deux marqueurs: Vδ1 et CD4 pour son isolement cellulaire magnétique positive. Vδ1 est un récepteur orphelin, alors que CD4 est exprimé sur les lymphocytes T auxiliaires, à un niveau inférieur sur les monocytes et les cellules dendritiques, et à un niveau très faible sur les cellules progénitrices hématopoïétiques. ...

Chez les vertébrés, l&#39;immunité adaptative qui est structuré dans le cellulaire et une partie de l&#39;immunité humorale joue un rôle majeur dans la défense contre les pathogènes. La reconnaissance d&#39;une large gamme d&#39;antigènes est médiée par hyperpolymorphic T et B des récepteurs de cellules (TCR / BCR), qui en ce qui concerne les cellules T sont supposés être produite principalement dans le thymus 1. Celui-ci, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), dérivées de moelle osseuse, le thymus semences et de différencier le long étapes bien définies finalement donné lieu à toutes les lignées de cellules T. Thymus progéniteurs ensemencement sont CD4 - et CD8 - et constituent donc la immature, double négatif (DN) fraction de thymocytes. Thymus signaux dérivés induisent alors leur engagement lignée et de la différenciation en soit des cellules T aß ou yô. L&#39;expression de TCR-y et TCR-ô gènes de chaîne fonctionnellement réarrangés en DN2 / 3 thymocytes conduit à y δTCR complexes, qui entraînent une de prolifération cellulaireD promouvoir la différenciation en cellules γ de 2,3 AT. En revanche, le réarrangement d&#39;une chaîne TCR-β fonctionnel, qui peut coupler avec preTα de construire un preTCR pT, induit la réduction au silence de la transcription de la chaîne TCR-γ dans les thymocytes DN3 et leur transition dans les thymocytes CD4 + CD8 + double-positifs 4 . A ce stade, la recombinaison de la chaîne TCR-α se produit, la suppression du locus TCR-δ qui se niche dans le locus TCR-α, abrogeant ainsi la production d&#39;un γδTCR dans ces cellules irrévocablement 5-9. ΑβTCRs réarrangés sont ensuite sélectionnés pour leur capacité à se lier auto-MHC faiblement (sélection positive), qui ne peut dépasser un certain seuil pour éviter l&#39;auto-immunité (sélection négative). Selon leur capacité de liaison I ou II du CMH de classe, les cellules αβT sélectionnés développer en cellules simple positif CD4 + ou T CD8 +, qui sortent du thymus lymphocytes T naïfs que. Cependant, l&#39;involution du thymus commence tôt dans la vie conduisant à exponentiellement réduit la production de cellules T naïves qui est presque éteinte post-adolescence 10. Néanmoins, la taille du pool de cellules T reste constante tout au long de la vie, qui peut être expliqué en partie seulement par une prolifération homéostatique post-thymique des lymphocytes T et la prolifération de long vécu mémoire immunologique 11. Par conséquent, le développement de cellules T extrathymique doit se produire. Des recherches récentes ont gagné activité importante qui a caractérisé progéniteurs des cellules αβT, qui au-extrathymique sites à donné lieu à aß fonctionnelle des cellules T 12-17. Pourtant, les connaissances détaillées sur extrathymique précurseurs de cellules que αβT indépendant d&#39;un thymus se différencier en cellules αβT est aussi fragmentaire que le fond que nous avons sur la route qu&#39;ils prennent de ce fait. Nous avons récemment identifié la petite entité T-cellule de Vδ1 + </sup&gt; cellules CD4 + γδT comme une cellule prognitor αβT extrathymique 18, qui, lorsqu&#39;il est isolé à partir du sang périphérique de donneurs humains en bonne santé peut transdifférencier dans les cellules αβT dans un environnement inflammatoire doux. Il est intéressant et contraire à la prolifération homéostatique des lymphocytes T post-thymiques, transdifférenciation des Vδ1 cellules CD4 + génère de nouveaux récepteurs de cellules T, élargissant ainsi la diversité du répertoire, de sorte que potentiellement de nouveaux antigènes peuvent être reconnus et peut protéger l&#39;hôte contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Cela ajoute à la plasticité des cellules T et ajoute une nouvelle voie jusqu&#39;ici incompris pour le développement de cellules T extrathymique. L&#39;isolement quantitative à partir de sources lymphocytaires, la génération de clones unicellulaires et leur expansion efficace sont essentiels pour l&#39;objectif d&#39;identifier les marqueurs et des molécules qui déclenchent cette cellule αβT precursor`s développement extrathymique.

<table><tbody><tr><td>Biocoll Solution</td><td>Biochrom</td><td>L 6113</td><td>lymphocyte separating solution</td></tr><tr><td>Lysing Buffer</td><td>BD BioSciences</td><td>555899</td><td>lysis of erythrocytes&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>supplement with BSA and pre-cool before use</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human Vd1 FITC (clone:&amp;nbsp; TS8.2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TCR2730</td><td>not mandatorily from this supplier</td></tr><tr><td>anti-human CD3 PerCP (clone: SK7)</td><td>BD BioSciences</td><td>345766</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31)</td><td>BD BioSciences</td><td>555548</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-333</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1)</td><td>BD BioSciences</td><td>641400</td><td>not mandatorily from this supplier or this flurochrome</td></tr><tr><td>Anti-FITC MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-058-701</td><td>yields better results than anti-FITC MicroBeads</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>pre-cool before use</td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Positive Isolation Kit</td><td>life technologies</td><td>11331D</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and ex vivo culture of v&#948;1+cd4+&#947;&#948; t cells, an extrathymic &#945;&#946;t-cell progenitor

Le thymus, l&#39;organe primaire pour la génération de cellules T aß et épine dorsale du système immunitaire adaptative chez les vertébrés, a longtemps été considérée comme la seule source de cellules αβT. Pourtant, involution thymique commence tôt dans la vie conduisant à une sortie considérablement réduit de cellules αβT naïfs dans la périphérie. Néanmoins, même les centenaires peuvent construire l&#39;immunité contre les agents pathogènes nouvellement acquises. Des recherches récentes suggèrent le développement des cellules αβT extrathymique, mais notre compréhension des voies qui peuvent compenser la perte de la fonction thymique sont encore rudimentaire. cellules γδ T sont des lymphocytes innées qui constituent le principal sous-ensemble de cellules T dans les tissus. Nous avons récemment attribué une fonction exceptionnelle jusqu&#39;ici incompris à un sous-ensemble de cellules T de γδ en montrant que l&#39;entité rare de CD4 + Vδ1 + γδ cellules T peuvent transdifférencier dans les cellules αβT dans des conditions inflammatoires. Ici, nous pournir le protocole pour l&#39;isolement de cette ancêtre du sang périphérique et sa culture subséquente. Vδ1 cellules sont positivement enrichis à partir de PBMC de donneurs humains en bonne santé en utilisant des billes magnétiques, suivie d&#39;une deuxième étape dans laquelle nous ciblons la fraction rares des cellules CD4 + avec une technique de marquage magnétique plus loin. La force magnétique de la deuxième étiquetage dépasse celui de la première étiquette magnétique, et permet ainsi l&#39;isolement positif efficace, quantitative et spécifique de la population d&#39;intérêt. On introduit ensuite l&#39;état de la technique et de la culture requise pour le clonage et efficacement l&#39;expansion des cellules et pour l&#39;identification des clones générés par analyse FACS. Ainsi, nous fournissons un protocole détaillé pour la purification, de la culture et de l&#39;expansion ex vivo de cellules CD4 + Vδ1 + yô Les cellules T. Cette connaissance est une condition préalable pour des études qui se rapportent à cette αβT progenitor`s de biologie cellulaire et pour ceux qui visent à IDEntifier les déclencheurs moléculaires qui sont impliqués dans son transdifférenciation.

La figure 1 illustre les différentes étapes et les résultats de l&#39;isolement de cellules T Vδ1 partir de sang périphérique. La figure 1A montre une distribution typique de Vδ1 cellules CD3 + dans les lymphocytes +, ainsi que la co-expression du récepteur de la population Vδ1 +. Dans ce donneur, la fréquence des cellules Vδ1 + (rouge) est de 2,3% du nombre total de lymphocytes CD4 et l&#39;expression (vert) de Vδ1 + ly...

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Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolement et<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Culture de Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; cellules γδ T, un extrathymique αβT cellules progénitrices

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

isolation-ex-vivo-culture-v1-cd4-t-cells-an-extrathymic-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

9.3K vues.  Children's University Hospital Tübingen. Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Vidéo: Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T cell replacement in lymphopenic patients. We studied thymic settling progenitors from murine embryonic day 13 and 18 thymi by two complementary in vitro and in vivo techniques, both based on the &#8220;hanging drop&#8221; method. This method allowed colonizing irradiated fetal thymic lobes with E13 and/or E18 thymic progenitors distinguished by CD45 allotypic markers and thus following their progeny. Colonization with mixed populations allows analyzing cell autonomous differences in biologic properties of the progenitors while colonization with either population removes possible competitive selective pressures. The colonized thymic lobes can also be grafted in immunodeficient male recipient mice allowing the analysis of the mature T cell progeny in vivo, such as population dynamics of the peripheral immune system and colonization of different tissues and organs. Fetal thymic organ cultures revealed that E13 progenitors developed rapidly into all mature CD3+ cells and gave rise to the canonical &#947;&#948; T cell subset, known as dendritic epithelial T cells. In comparison, E18 progenitors have a delayed differentiation and were unable to generate dendritic epithelial T cells. The monitoring of peripheral blood of thymus-grafted CD3-/- mice further showed that E18 thymic settling progenitors generate, with time, larger numbers of mature T cells than their E13 counterparts, a feature that could not be appreciated in the short term fetal thymic organ cultures.

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

This article describes in vivo and in vitro methodology to characterize the thymic settling progenitors by the analysis of the kinetics of generation, phenotype and numbers of their T cell progeny.

Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l&#39;embryon de souris Utilisation<em&gt; In Vivo</em&gt; Et<em&gt; In Vitro</em&gt; Essais

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Recherche

Biologie du développement

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Biologie

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Immunologie et infection

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major histocompatibility complex (MHC)-independent manner and develop strong cytolytic effector function that makes it an ideal candidate for cancer immunotherapy. Due to the low frequency of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cells in the peripheral blood, we developed an effective protocol to greatly expand a highly pure &#947;&#948; T cells drug product for first-in-human use of allogeneic &#947;&#948; T cells in patients with acute myeloid leukemia (AML). Using healthy donor apheresis as an allogenic cell source, the lymphocytes are isolated using a validated device for a counterflow centrifugation method of separating cells by size and density. 
The lymphocyte-rich fraction is utilized, and the &#947;&#948; T cells are preferentially activated with zoledronic acid (FDA-approved) and interleukin (IL)-2 for 7 days. Following the preferential expansion of &#947;&#948; T cells, a clinical-grade magnetic cell-separation device and TCR&#945;&#946; beads are used to deplete contaminating T-cell receptor (TCR)&#945;&#946; T cells. The highly enriched &#947;&#948; T cells then undergo a second expansion using engineered artificial antigen-presenting cells (aAPCs) derived from K562 cells-genetically engineered to express single-chain variable fragment (scFv) for CD3 and CD28, 41BBL (CD137L) and IL15-RA-together with zoledronic acid and IL-2. Seeding all day-7 enriched &#947;&#948; T cells in co-culture with the aAPCs facilitates the manufacture of highly pure &#947;&#948; T cells with an average fold expansion of &gt;229,000-fold from healthy donor blood.

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Presented is a protocol for the expansion of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T cell drug product. Lymphocytes are isolated by elutriation and &#947;&#948;-enriched with zoledronic acid and interleukin-2. Alpha-beta T cells are depleted using a clinical-grade magnetic separation device. The &#947;&#948; cells are co-cultured with K562-derived, artificial antigen-presenting cells and expanded.

Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Recherche en cancérologie

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Souris Naïf CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolement des cellules T et<em&gt; In vitro</em&gt; Différenciation en sous-ensembles de cellules T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Étude de la calcification de la valve aortique par isolement et culture de lymphocytes T à l’aide de cellules nourricières de Buffy Coat irradié

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

<meta charset="utf8"></head><body>Technique d’imagerie à haute résolution pour la détection de microdomaines Ca2+ dans les lymphocytes T

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and might already determine the fate of a T cell. Upon T cell receptor activation, NAADP is formed rapidly, binding to NAADP binding proteins (HN1L/JPT2, LSM12) and their respective receptors (RyR1, TPC2) sitting on intracellular Ca2+ stores, like the ER and lysosomes, and leading to subsequent release and elevation of [Ca2+]i. To capture these fast and dynamically occurring Ca2+ signals, we developed a high-resolution imaging technique using a combination of two Ca2+ indicators, Fluo-4 AM and FuraRed AM. For postprocessing, an open-source, semi-automated Ca2+ microdomain detection approach was developed based on the programming language Python. Using this workflow, we are able to reliably detect Ca2+ microdomains on a subcellular level in primary murine and human T cells in high temporal and spatial resolution fluorescence videos. This method can also be applied to other cell types, like NK cells and murine neuronal cell lines.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Démêler l’activation initiale de la réponse immunitaire adaptative pour l’intervention thérapeutique

Here, we provide a comprehensive protocol to resolve initial local Ca2+ signals, known as Ca2+ microdomains, in primary murine and human T cells using fluorescence microscopy. This protocol serves as a valuable resource for researchers examining Ca2+ signaling pathways within immune cells and to further unravel their function.

Imagerie des microdomaines Ca2+ initiaux dans les lymphocytes T primaires

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

Isolement et

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Caractérisation des progéniteurs thymique décantation dans l'embryon de souris Utilisation

Préparation de la 2-dGuo cultures traitées orgue Thymus

L'isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Isolement, identification et la purification de cellules murines thymique épithéliales

Souris Naïf CD4

Étude de la calcification de la valve aortique par isolement et culture de lymphocytes T à l’aide de cellules nourricières de Buffy Coat irradié

Imagerie des microdomaines Ca²⁺ initiaux dans les lymphocytes T primaires

Imagerie des microdomaines Ca²⁺ initiaux dans les lymphocytes T primaires

Imagerie des microdomaines Ca²⁺ initiaux dans les lymphocytes T primaires