InDevR reconnaît NIH / NIAID U01AI070276 et R43AI077112 du financement de ce travail.

1. Exemple d&#39;amplification par RT-PCR <ol><li> Extrait d&#39;ARN viral à partir du matériel clinique ou un isolat viral en utilisant le kit Qiagen MinElute Spin virus en conjonction avec la plate-forme automatisée QIAcube extraction d&#39;acides nucléiques. Les extractions sont effectuées sur des échantillons 200 ul avec un volume d&#39;élution finale de 60 pl. Extraits conserver à -70 ° C ou moins pour une utilisation ultérieure. </li><li> Dans un modèle de libre-région, préparer le mélange de RT-PCR maître sur la glace selon le protocole du fabricant. Pour intégrer la biotine lors de la RT-PCR, utiliser un mélange de dNTP biotinylé en place du fabricant fourni mélange de dNTP. Le coût d&#39;utilisation d&#39;un mélange de dNTP biotinylé est inférieur à 1 $ USD / dosage. Des méthodes alternatives de l&#39;incorporation de biotine comme l&#39;utilisation d&#39;une amorce biotinylée peut également être utilisé. Ajouter apprêt mêle à des concentrations finales de 1,0 uM pour la grippe A, 1,0 uM pour B grippe, et 0,14 uM pour le contrôle interne. La grippe A amorces amplifie le segment de gène de la matrice (1032 produits NT) et l&#39;ensemble B Grippe apprêt amplifie un segment de gène non structurelles (811 produits NT). Chaque ensemble d&#39;amorces FluChip contient une amorce avec un 5 &#39;groupe phosphoryle pour faciliter la génération d&#39;ADN simple brin par digestion enzymatique avec exonucléase lambda PCR suivant. Le produit résultant simple brin nécessite des temps beaucoup plus courte que l&#39;hybridation l&#39;équivalent double brin et raccourcit considérablement le temps de dosage global. Un mélange préparé à l&#39;avance de ces amorces ainsi que l&#39;ARN modèle de contrôle interne sont disponibles à partir InDevR aux chercheurs intéressés sur une base limitée. </li><li> Brièvement au vortex et de distribuer 18 ul du mélange maître dans des tubes PCR à paroi mince. </li><li> Transfert des tubes sur la glace à un espace de travail adapté à plus de modèle, et d&#39;ajouter deux modèles ul dans chaque tube de réaction. </li><li> Transfert des tubes PCR pour un cycleur thermique, et exécutez le profil thermique suivant: transcription inverse à 50 ° C pendant 30 min, l&#39;inactivation des enzymes / activation à 95 ° C pendant 15 min, 40 cycles de PCR de 95 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30s, et 72 ° C pendant 1 min, et une extension finale à 72 ° C pendant 10 min. </li></ol> 2. L&#39;hybridation des produits RT-PCR à puces à faible densité <ol><li> Afin de générer un ADN simple brin d&#39;hybridation FluChip, préparer le mélange de digestion enzymatique par des enzymes combinant 1,0 ul exonucléase lambda, 2,2 ul du tampon de réaction d&#39;accompagnement, et de 0,8 l de l&#39;eau sans nucléase. Ces montants sont pour un seul échantillon, mais peut être tout simplement à l&#39;échelle pour le nombre total d&#39;échantillons à être digéré. Retirer les échantillons du thermocycleur et ajouter 4 ul du mélange préparé à chaque réaction à digérer le brin phosphorylés du produit de PCR. Retour d&#39;échantillons à l&#39;thermocycleur et le programme du thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi par 95 degrés Celsius pendant 10 minutes pour compléter la digestion enzymatique et la fragmentation des mesures de chaleur. </li><li> Les puces à la grippe personnalisés utilisés sont imprimés sur des lames de verre fonctionnalisées aldéhyde par Applied Microarrays Inc (Tempe, AZ). 5&#39;-amino séquences de capture résilié sont combinés avec une mémoire tampon optimisée des taches et imprimés à une concentration finale de 20 uM (sauf pour la séquence de contrôle positif, qui a en outre une modification 3&#39;-biotine et est repéré à une concentration finale de 500 nM) . Un contact non-spotting méthode est utilisée, avec un diamètre de la tache optimale de 300 um et le centre à la hauteur du centre de 700 um. </li><li> Retirer microarrays dans la zone de stockage et d&#39;appliquer des puits hybridation à usage unique autour de la microarrays en enlevant la feuille de protection et en appuyant fermement autour du périmètre bien. </li><li> Placer les lames dans un bac de lavage contenant 110 ml d&#39;eau purifiée pour 5 min de pré-hybridation laver en utilisant un agitateur orbital à 60-90 min. Sécher le tableau en touchant légèrement le tissu d&#39;un essuie-glace au bord du puits et permettant à l&#39;eau d&#39;être méchant loin. </li><li> Combinez 22 pi de tampon d&#39;hybridation 2x avec chacun des produits ADNss fragmenté, et une pipette 40 ul de la solution d&#39;hybridation dans les puits de biopuces. </li><li> Autoriser diapositives à s&#39;hybrider dans la chambre de l&#39;humidité fermée pendant 60 minutes. </li><li> Retirez les diapositives de la chambre humide, rincez brièvement tableaux avec le tampon de lavage D dans une bouteille de rincer avant de les placer dans le rack de diapositives. Typiquement le volume de rinçage de tampon de lavage D est de 2 ml par baie. Placer la lame en rack contenant des diapositives dans un bac de lavage contenant 110 ml de tampon de lavage Placez bin A. agitateur orbital à 60-90 rpm pendant 1 minute. </li><li> Retirer support glisser de tampon de lavage A, brièvement rincer avec le tampon de lavage D, support glisser le transfert vers un bac contenant un tampon de lavage B et agiter à 60-90 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Séchez délicatement le tableau sur chaque diapositive, puis placez lames séchées dans la chambre de l&#39;humidité dans la préparation des étapes ampliPHOX détection colorimétrique. </li></ol> 3. ampliPHOX: l&#39;étiquetage des produits hybrides et des puces de calibration avec ampliTAG <ol><li> Combinent<html> 10 ul de ampliTAG, 20 pl de tampon ampliTAG 2x, et 10 pl d&#39;eau purifiée pour chaque tableau pour être traitées. Volumes de réactif peut être simplement réduit le nombre total d&#39;échantillons. Assurez-vous de préparer le mélange d&#39;étiquetage suffisant pour rendre compte de tous les tableaux et les tableaux de l&#39;échantillon d&#39;étalonnage nécessaires. Le nombre de jetons d&#39;étalonnage nécessaires dépend de si vous effectuez un étalonnage complet (pour un nouvel instrument ou nouveau lot de réactifs), ou tout simplement un chèque instrument. Pour un étalonnage complet, 3 puces de calibration doivent être étiquetés, et pour un chèque de réactifs, juste une puce d&#39;étalonnage unique devraient être étiquetés. S&#39;il vous plaît noter que, avant les tableaux d&#39;étalonnage sont étiquetés, ils devraient passer par l&#39;étape de lavage pré-hybridation qui a été décrit précédemment pour les tableaux de la grippe. </li><li> Transfert 40 ul de mélange étiquette pour chaque tableau, et permettent l&#39;étiquetage réaction se dérouler dans une chambre humide fermée pendant 5 minutes. </li><li> Rincer immédiatement tableaux avec le tampon de lavage D dans une bouteille de rincer avant de les placer dans un rack diapositives diapositive. Transfert en rack dans le bac contenant 110 ml de tampon de lavage C et agiter à 60-90 rpm pendant 5 minutes. </li><li> Utiliser un bac rempli de second lavage de l&#39;eau purifiée, effectuer trois années consécutives de bains d&#39;eau brève pour enlever les résidus de sel. Sécher les tableaux en touchant doucement un essuie-glace sur le bord du tissu des puits. </li><li> Les biopuces sont maintenant correctement étiquetés avec ampliTAG, et le reste de la procédure de détection ampliPHOX peut être effectuée. Photoactivation et l&#39;imagerie de tableaux étiquetés devrait être achevé dans les 24 heures, et des tableaux supplémentaires peuvent être stockés dans une boîte à lames sombres jusqu&#39;à l&#39;utilisation. </li></ol> 4. ampliPHOX: étalonnage, l&#39;amplification du signal, et l&#39;imagerie <ol><li> Tournez ampliPHOX lecteur sur le logiciel et assurer ampliVIEW est prêt pour la photoactivation. </li><li> Déterminer le moment optimal photoactivation utilisant des puces de calibration. En plus de la brève introduction qui suit, cette procédure est également décrite en détail dans le manuel d&#39;utilisation ampliPHOX. Les puces de calibration contient une série de dilutions d&#39;une séquence de contrôle biotinylé qui sont utilisés pour optimiser la sensibilité de l&#39;essai, avec l&#39;objectif de maximiser le nombre de lignes de la puce de calibration qui produisent un signal positif tel que déterminé par le logiciel. </li><li> Retirer ampliPHY de 4 ° C, laisser réchauffer à température ambiante, et le vortex brièvement pour mélanger. Pipet 3 ul d&#39;ampliPHY d&#39;activateur dans le flacon ampliPHY, et le vortex soigneusement pendant 10 secondes. </li><li> Uniformément transférer 40 ul de la solution ampliPHY dans la puce contenant le même ampliTAG marqué tableau, veiller à ce qu&#39;aucun des bulles sont présentes. Fermer le flacon ampliPHY entre chaque application. Insérez la diapositive puces dans la baie du lecteur de photoactivation ampliPHOX. </li><li> Pour le tableau de calibrage d&#39;abord, utiliser le temps photoactivation par défaut dans le &quot;Temps&quot; boîte sur le panneau de gauche du logiciel et cliquez sur &quot;Démarrer&quot; sur le bouton vert pour commencer la photoactivation. Une fois terminé, retirez le tableau et rincer à l&#39;eau purifiée pour enlever l&#39;excès ampliPHY. Effacer formation de polymère sur certains des points doit maintenant être visible. </li><li> Laisser les gouttes de polymère à sécher pendant 2 minutes, puis distribuer deux gouttes d&#39;ampliRED sur la matrice et permettent de procéder coloration pendant 2 minutes. </li><li> Ensuite, rincer rapidement puce à ADN avec de l&#39;eau purifiée et sécher avec un tissu essuyer. </li><li> Insérer puces dans la baie d&#39;imagerie du lecteur ampliPHOX, et cliquez sur le bouton «nouvelle image de capture dans l&#39;onglet Image. Une fois imagé, ajuster la culture et de sauvegarder l&#39;image. </li><li> Dans l&#39;onglet Analyse, sélectionnez le masque puce d&#39;étalonnage et le bouton «Placement automatique» pour lancer l&#39;analyse. Le logiciel va automatiquement produire un «compte rendu» montrant les résultats quantifiés. Basé sur ces résultats, le temps de photoactivation est ajusté de 10 secondes pour le tableau de calibrage seconde, et la procédure est répétée. </li><li> Une fois le temps photoactivation optimale a été déterminée, les tableaux de l&#39;échantillon peut être traité en utilisant l&#39;amplification du signal et des mêmes protocoles d&#39;imagerie utilisés pour les tableaux d&#39;étalonnage. </li><li> Une fois que l&#39;image est capturée pour les tableaux de l&#39;échantillon, un masque pour votre mise en page de tableau particulier, comme la mise en réseau de la grippe décrites ici peuvent être created.The ampliVIEW logiciel est capable d&#39;effectuer l&#39;analyse d&#39;image automatisée et générer des résultats de la grippe de sous-typage pour chaque échantillon. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Illustration schématique de la méthode de détection colorimétrique ampliPHOX. (A) d&#39;ADN cible biotinylé est hybride à chaque tache dans le tableau, et (B) marqué avec ampliTAG. (C) solution ampliPHY est ensuite ajouté, et (D) exposés à la lumière pour former des taches visibles polymère. (E) Les taches polymère formé sont ensuite colorés avec un colorant non toxique pour améliorer le contraste. ONTENU &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2 (A). Grippe mise bas biopuces densité. Séquences 1-7 et 10-13 de la grippe A cibles, et les séquences 8, 9 cibles influenza B. (B) ampliPHOX et (C) des images de fluorescence d&#39;un roman de 2009 («grippe porcine») H1N1 spécimen démontrant le motif de détection par les deux mêmes méthodes. <img src="/files/ftp_upload/2682/2682fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. De gauche à droite, des images représentatives ampliPHOX pour la grippe A H3N2, H1N1 d&#39;origine humaine, 2009 H1N1 (d&#39;origine porcine), et un spécimen négatif. Tous les 3 sous-types montrent les modèles visuellement distincte sur le tableau. Notez que dans la négative que seul le contrôle interne est considéré MS2, indiquant l&#39;amplification par RT-PCR n&#39;a pas été inhibée.

<ol>
	<li>Kumar, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Widely+Used+Diagnostics+"DNA-Microarray"-A+Review.">The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review.</a> Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).</li><li>Miller, M. B., Tang, Y. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Concepts+of+Microarrays+and+Potential+Applications+in+Clinical+Microbiology.">Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology.</a> Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).</li><li>Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+microarrays+in+the+clinic:+infectious+diseases.">DNA microarrays in the clinic: infectious diseases.</a> BioEssays. 30, 673-682 (2008).</li><li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+for+pathogen+detection+using+DNA+microarrays.">Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays.</a> Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li><li>Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+does+the+future+hold+for+clinical+microbiology.">What does the future hold for clinical microbiology.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).</li><li>Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MChip:+A+Single+Gene+Diagnostic+for+Influenza+A.">MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A.</a> Influenza: Molecular Virology. , (2010).</li><li>Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+hemagglutinin+subtyping+and+pathotyping+of+avian+influenza+viruses+by+a+DNA+microarray.">Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray.</a> J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).</li><li>Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluChip:+Experimental+evaluation+of+a+diagnostic+influenza+microarray.">FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray.</a> J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).</li><li>Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+influenza+viruses+with+resequencing+arrays.">Identifying influenza viruses with resequencing arrays.</a> Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).</li><li>Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+DNA+Flow-Thru+Chip,+a+three-dimensional+biochip,+for+typing+and+subtyping+of+influenza+viruses.">Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses.</a> J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).</li><li>Kuck, L. R., Taylor, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photopolymerization+as+an+innovative+detection+technique+for+low-density+microarrays.">Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays.</a> Biotechniques. 45, 179-186 (2008).</li><li>Avens, H. J., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fluorescent+polymerization-based+signal+amplification+for+sensitive+and+non-enzymatic+biodetection+in+antibody+arrays.">Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays.</a> Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).</li><li>Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+detection+using+polymerization-based+amplification.">Antigen detection using polymerization-based amplification.</a> Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).</li></ol>

Tous les auteurs sont des employés de InDevR, Inc, une entité à but lucratif. InDevR commercialise la technologie ampliPHOX décrits.

La technologie de détection colorimétrique ampliPHOX présenté ici est un rapide, alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence seule couleur pour les applications des biopuces baisse de densité. Schématisé à la figure 1, le principe de détection est basée sur l&#39;utilisation d&#39;un label de photoamorceur (1B). En présence d&#39;une solution contenant du monomère (1C), exposition à la lumière des causes du photoamorceur (ampliTAG) pour déclencher une réaction de polymér...

<table border="1"><tbody><tr><th> Réactif / équipement </th><th> Fabricant </th><th> Catalogue # </th><th> Commentaires </th></tr><tr><td> Qiagen MinElute Kit Spin Virus </td><td> Qiagen </td><td> 57704 </td><td> unique de 60 ul d&#39;élution </td></tr><tr><td> QIAcube </td><td> Qiagen </td><td> 9001292 </td><td> optionnelle </td></tr><tr><td> ABI 9800 Rapide thermocycleur </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4441166 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen </td><td> 210210 </td><td> Kit dNTP pas utilisé </td></tr><tr><td> 2x tampon Spotting </td><td> InDevR Inc </td><td> MI-5007 </td><td></td></tr><tr><td> Biotinylé mélange de dNTP </td><td> InDevR Inc </td><td> MI-5009 </td><td></td></tr><tr><td> Exonucléase lambda </td><td> Biotechnologies Epicentre </td><td> LE032K </td><td> 2500 U, 10U/μl </td></tr><tr><td> Mélange d&#39;amorces FluChip </td><td> InDevR </td><td> N / A </td><td> pas encore disponibles à la vente </td></tr><tr><td> Orbital Shaker </td><td> Madell technologie </td><td> ZD-9556-A </td><td></td></tr><tr><td> Lavez bacs </td><td> InDevR Inc </td><td> MI-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Lavez Racks </td><td> InDevR Inc </td><td> MI-4003 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;Hybridation 2x </td><td> InDevR Inc </td><td> MI-5004 </td><td></td></tr><tr><td> Chips de calibration </td><td> InDevR Inc </td><td> AP-5006 </td><td></td></tr><tr><td> Lavez Tampons AD </td><td> InDevR Inc </td><td> MI-5005 </td><td></td></tr><tr><td> ampliRED </td><td> InDevR Inc </td><td> AP-5004 </td><td></td></tr><tr><td> ampliTAG </td><td> InDevR Inc </td><td> AP-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2x ampliTAG Tampon </td><td> InDevR Inc </td><td> AP-5002 </td><td></td></tr><tr><td> ampliPHY, ampliPHY enhancer </td><td> InDevR Inc </td><td> AP-5003 </td><td></td></tr></tbody></table>

ampliphox colorimetric detection on a dna microarray for influenza

Puces à ADN sont apparues comme un puissant outil de détection des agents pathogènes. 1-5, par exemple, de nombreux exemples de la capacité de type et de sous-type du virus grippal ont été démontrés. 6-11 L&#39;identification et le typage de la grippe sur les puces à ADN a des applications dans les deux publics la santé et de la clinique pour la détection précoce, d&#39;intervention rapide, et en minimisant l&#39;impact d&#39;une pandémie de grippe. Fluorescence traditionnelle est actuellement la méthode la plus couramment utilisée puces de détection. Cependant, comme la technologie des biopuces progresse vers une utilisation clinique, une instrumentation coûteuse remplacer à faible coût de la technologie de détection présentant des caractéristiques de performance similaire à la fluorescence fera des essais biopuces plus attractif et rentable. La technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est destiné aux applications de recherche, et a une limite de détection au sein d&#39;un ordre de grandeur de la fluorescence traditionnelle 11, avec un avantage principal étant une approximative de dix fois moindre coût instrument par rapport aux scanners biopuces à fluorescence confocale requis pour biopuces détection. Un autre avantage est la taille compacte de l&#39;instrument qui permet pour la portabilité et la flexibilité, à la différence des instruments traditionnels de fluorescence. Parce que la technologie de polymérisation n&#39;est pas comme intrinsèquement linéaire comme la détection par fluorescence, cependant, il est le mieux adapté à la densité plus faible applications des biopuces dans lequel une réponse oui / non de la présence d&#39;une certaine séquence est souhaitée, comme pour les tableaux de détection de pathogènes. Actuellement, la densité maximale du spot compatible avec la détection ampliPHOX est ~ 1800 spots / tableau. En raison des limites de densité au comptant, biopuces haute densité ne sont pas adaptés pour la détection ampliPHOX. Ici, nous présentons la technologie ampliPHOX détection colorimétrique comme une méthode d&#39;amplification du signal sur une puce à faible densité développé pour la détection et la caractérisation des virus de la grippe (FluChip). Bien que ce protocole utilise le FluChip (une puce à ADN) comme une application spécifique de ampliPHOX détection, aucune puce incorporant cibles biotinylées peuvent être étiquetés et détectée d&#39;une manière semblable. La conception de microréseau et biotinylation de la cible pour être capturés sont de la responsabilité de l&#39;utilisateur. Une fois la cible biotinylé a été capturé sur le tableau, la détection ampliPHOX peut être effectuée par le marquage d&#39;abord le tableau avec un conjugué streptavidine-étiquette (ampliTAG). Après exposition à la lumière en utilisant l&#39;instrument de ampliPHOX Reader, la polymérisation d&#39;une solution de monomère (ampliPHY) ne se produit que dans des régions contenant ampliTAG marqué cibles. Le polymère formé peut être ensuite colorées avec une solution non toxique pour améliorer le contraste visuel, suivi par imagerie et d&#39;analyse en utilisant un logiciel simple (ampliVIEW). Le dosage de FluChip entière de l&#39;ONU-échantillon extrait d&#39;entraîner peut être effectuée en environ 6 heures, et les mesures de détection ampliPHOX décrit ci-dessus peut être complété en environ 30 min.

Watch this Scientific Journal Video about ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza at JoVE.com

ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est présentée comme une alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence pour les microarrays. Basé sur la photopolymérisation, ampliPHOX produit des taches polymère solide visible à l&#39;œil nu dans quelques minutes. Les résultats sont ensuite imagé et automatiquement interprété avec un logiciel simple mais puissant.

ampliPHOX détection colorimétrique sur un microréseau d&#39;ADN pour la grippe

DNA microarrays have emerged as a powerful tool for pathogen detection.1-5  For instance, many examples of the ability to type and subtype influenza virus ...

ampliphox-colorimetric-detection-on-a-dna-microarray-for-influenza

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.9K vues.  InDevR Inc.. technologie de détection colorimétrique ampliPHOX est présentée comme une alternative peu coûteuse à la détection par fluorescence pour les microarrays. Basé sur la photopolymérisation, ampliPHOX produit des taches polymère solide visible à l'œil nu dans quelques minutes. Les résultats sont ensuite imagé et automatiquement interprété avec un logiciel simple mais puissant.

Vidéo: ampliPHOX Colorimetric Detection on a DNA Microarray for Influenza

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Génération de virus recombinants de la grippe des ADN plasmidique

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Recherche

Immunologie et infection

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in situ hybridization (FISH) for rapid culture-independent detection of Salmonella spp. Cell-charged tapes can also be placed face-down on selective agar for solid-phase enrichment prior to detection. Alternatively, low-volume liquid enrichments (liquid surface miniculture) can be performed on the surface of the tape in non-selective broth, followed by FISH and analysis via flow cytometry. To begin, sterile adhesive tape is brought into contact with fresh produce, gentle pressure is applied, and the tape is removed, physically extracting microbes present on these surfaces. Tapes are mounted sticky-side up onto glass microscope slides and the sampled cells are fixed with 10% formalin (30 min) and dehydrated using a graded ethanol series (50, 80, and 95%; 3 min each concentration). Next, cell-charged tapes are spotted with buffer containing a Salmonella-targeted DNA probe cocktail and hybridized for 15 - 30 min at 55&deg;C, followed by a brief rinse in a washing buffer to remove unbound probe. Adherent, FISH-labeled cells are then counterstained with the DNA dye 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) and results are viewed using fluorescence microscopy. For solid-phase enrichment, cell-charged tapes are placed face-down on a suitable selective agar surface and incubated to allow in situ growth of Salmonella microcolonies, followed by FISH and microscopy as described above. For liquid surface miniculture, cell-charged tapes are placed sticky side up and a silicone perfusion chamber is applied so that the tape and microscope slide form the bottom of a water-tight chamber into which a small volume (&le; 500 &mu;L) of Trypticase Soy Broth (TSB) is introduced. The inlet ports are sealed and the chambers are incubated at 35 - 37&deg;C, allowing growth-based amplification of tape-extracted microbes. Following incubation, inlet ports are unsealed, cells are detached and mixed with vigorous back and forth pipetting, harvested via centrifugation and fixed in 10% neutral buffered formalin. Finally, samples are hybridized and examined via flow cytometry to reveal the presence of Salmonella spp. As described here, our "tape-FISH" approach can provide simple and rapid sampling and detection of Salmonella on tomato surfaces. We have also used this approach for sampling other types of fresh produce, including spinach and jalape&ntilde;o peppers.

Combination of Adhesive-tape-based Sampling and Fluorescence in situ Hybridization for Rapid Detection of Salmonella on Fresh Produce

This protocol describes a simple adhesive-tape-based approach for sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by rapid whole cell detection of Salmonella using fluorescence in situ hybridization (FISH).

Combinaison de adhésif à base de bandes d&#39;échantillonnage et de fluorescence In situ</emHybridation> pour la détection rapide des Salmonella Sur les produits frais

This protocol describes a simple approach for adhesive-tape-based sampling of tomato and other fresh produce surfaces, followed by on-tape fluorescence in ...

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

Utiliser l&#39;imagerie Bioluminescent chargé d&#39;enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

En utilisant un dosage Microarray pan-virale (Virochip) pour cribler des échantillons cliniques pour les pathogènes viraux

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

Méthode de détection à haut débit pour les virus de la grippe

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Lingettes nasal pour la grippe détection d&#39;un virus et l&#39;isolement des porcs

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

A miniaturisé Glycan Microarray Assay pour l&#39;évaluation Avidité et Spécificité du virus grippal A Hémagglutinines

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In Vitro désassemblage du virus grippal A capsides par Centrifugation Gradient

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...

Rapid Molecular Detection and Differentiation of Influenza Viruses A and B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality every year. The Influenza A and B assay was the first CLIA-waived molecular rapid flu test available. The Influenza A and B test works by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. Here, the performance of the Influenza A and B assay on frozen, archived nasopharyngeal swab (NPS) specimens stored in viral transport medium (VTM) were compared to a respiratory panel assay.
The performance of the Influenza A and B assay was evaluated by comparing the results to the respiratory panel reference method. The sensitivity for total influenza virus A was 67.5% (95% CI (CI), 56.6-78.5) and the specificity was 86.9% (CI, 71.0-100). For influenza virus B testing, the sensitivity and specificity were 90.2% (CI, 68.5-100) and 98.8% (CI, 68.5-100), respectively.
This system has the advantage of a significantly shorter test time than any other currently available molecular assay and the simple, pipette-free procedure runs on a fully integrated, closed, small-footprint system. Overall, the Influenza A and B assay evaluated in this study has the potential to serve as a point-of-care rapid influenza diagnostic test.

We describe a rapid, molecular-based Influenza A and B assay. The Influenza assay detects each target within 15 min by employing isothermal amplification with influenza-specific primers followed by target detection with molecular beacon probes. The Influenza A and B assay is user-friendly and required minimal hands-on time to perform.

Rapid Détection moléculaire et différenciation des virus grippaux A et B

Influenza is a contagious respiratory illness caused by influenza viruses A and B in humans and causes a significant amount of morbidity and mortality ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

Basées sur la fluorescence neuraminidase Essai d&#39;inhibition pour évaluer la sensibilité des virus de la grippe à la neuraminidase Inhibiteur Classe de Antiviraux

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...