Cette recherche a été financée par les Instituts nationaux de la santé (NIH) subvention R01 EB008268.

1. 12 Fabrication puce <ol><li> Faites deux plaques de pastilles 690R Zeonex: distribuer des pastilles de 8-9 grammes Zeonex uniformément dans le centre d&#39;une plaque de métal, préchauffer à la presse chauffée à 198 ° C pendant 5 min, puis appliquer une pression lentement à 2.500 psi pour encore 5 min. Pour compléter cette étape, nous avons utilisé une presse Carver chaude. </li><li> Gaufrer le canal microfluidique dans la plaque de moule avec une résine époxy. Détails sur le moule de fabrication sont décrites ailleurs 12 (canal de la conception à la figure 2b): mettez une plaque sur le moule époxy; préchauffer sur la presse chauffée à 157 ° C pendant 10 minutes, puis appliquer lentement la pression à 1.000 psi pendant 10 min . Retirer la plaque du moule à la main ou à l&#39;aide d&#39;une pince avant qu&#39;il ne refroidisse. (Remarque: portez des gants thermiques au cours de cette étape.) </li><li> Percer des trous dans la puce en relief à l&#39;entrée, le port déchets, et la sortie du canal microfluidique. Nous avons utilisé un diam 1,25 mmEter foret de faire les trois trous. </li><li> Bond de la puce en relief avec une autre plaque (en haut): Laver les copeaux avec de l&#39;IPA, RNase Away et de l&#39;eau déminéralisée en séquence; Air sec et préchauffer à la presse chauffée à 131 ° C pendant 10 min, puis appuyez à 350 psi pour un autre 10 min. </li><li> Fixez Nanoports à l&#39;entrée, les déchets et les orifices de sortie séparément à l&#39;aide JB Weld époxy; durcir pendant 15 à 24 heures selon les instructions du fabricant. </li><li> Rincer le canal SPE avec 50 pi loin RNAse, puis avec 100 pl d&#39;eau nucléase libre. </li><li> Charger le canal SPE avec 4 ul de la solution de greffage (méthacrylate de méthyle avec 3% p / v benzophénone), puis réticuler le méthacrylate par une incubation de 10 minutes dans un four UV sous UV de longueur d&#39;onde nm et 365 2.000 mJ / cm 2. Retirer la solution résiduelle greffage avec vide. Nous avons utilisé le vide du mur. Pour de meilleurs résultats, une nouvelle solution doit être utilisée. Il est généralement acceptable, mais, pour enregistrer unsolution préparée à 4 ° C pendant une semaine. </li><li> Rendre la solution colonne SPE (tous les% en volume / volume): diméthacrylate d&#39;éthylène 16%, 24% de méthacrylate de butyle, 42% de 1-dodécanol, le cyclohexanol 18%, et à 1% de 2-diméthylamino-4-(méthyl-phénylamino)-phénol que le photo-initiateur. </li><li> Sortez le même volume de solution de microsphères de silice comme la solution la colonne SPE (pour faire un mélange 1:1), et l&#39;a complètement sécher à 70 ° C pendant la nuit dans un four sous vide. Brisez le culot en tapant sur le tube avec le couvercle fermé. Ajouter la solution de la colonne SPE dans le tube de microsphères de silice séchée et vortex pour mélanger. </li><li> Chargez 4 pl de la solution SPE dans le même canal, puis réticuler par irradiation UV pendant 2,5 min. Ensuite, retournez sur la puce et d&#39;irradier un autre min 2,5. La colonne SPE polymérisée doit être un solide blanc opaque. </li><li> Laver la chaîne avec 500 ul de méthanol à 100% pour rincer réactifs en excès. Ce lavage élimine aussi intra-polymère porogenic solvants, créant ainsi la structure à pores ouverts de la colonne SPE quand on le sèche dans les conditions ambiantes. </li><li> Fixer deux appareils de chauffage à film mince au fond de la puce avec un ruban conducteur de la chaleur. Les côtés des appareils de chauffage doit être aligné avec le bord des canaux larges de dénaturation et hybridation séparément (voir la figure 1). </li><li> Placez les cinq thermocouples dans la puce à travers les morts clos canaux latéraux ouverts de chaque puce (voir figure 2b). Les thermocouples rester dans ces canaux via ajustement serré. Bande a été utilisé pour fixer en outre l&#39;emplacement des thermocouples. </li></ol> 2. Méthode d&#39;extraction en phase solide <ol><li> Préparer 96 ul d&#39;éthanol à 70% avec de l&#39;eau traitée au DEPC et autoclavés (déminéralisée ou filtrée Millipore). </li><li> Ajouter 4 ul d&#39;ARN 25X Fixer à 96 ul d&#39;éthanol à 70% dans un tube, et de dupliquer le même mélange avec de l&#39;éthanol à 100% dans un tube séparé. </li><li> Préparez 300pl de tampon de canal en mélangeant ce qui suit: 75 pl de 6 M de thiocyanate de guanidine (GuSCN), 150 ul de 2-propanol, 63 pl de nucléase libre de l&#39;eau, et 12 pl de l&#39;ARN 25X sécurisés. </li><li> Préparer 312 ul de tampon de lyse en mélangeant: 100 pl de 6 M GuSCN, 200 pl de 2-propanol et 12 ul d&#39;ARN 25X sécurisés. </li><li> Chauffer l&#39;éthanol à 70%, 100% de tampon canal d&#39;éthanol, et tampons de lyse à 60 ° C pendant 10-20 min pour activer le sécurisé ARN. </li><li> Pour équilibrer le canal microfluidique, exécuter le tampon de canal par l&#39;intermédiaire du canal de SPE à un débit de 0,8 ml / h. </li><li> Quick-dégeler l&#39;échantillon d&#39;essai de VTM à 37 ° C au bain-marie, puis retirez immédiatement l&#39;échantillon du bain d&#39;eau dès qu&#39;il est décongelé. </li><li> Centrifuger l&#39;échantillon à 13000 rpm pendant 10 min, et transférer 100 ul de surnageant dans 300 ul de tampon de lyse. Remplissez le mélange en ajoutant 6 pi de 1 ug / ul ARN porteur. </li><li> Vortex pour mélanger, et après de spin pour5 sec, chargez l&#39;intégralité du lysat dans un Luer-lok 1 seringue cc. </li><li> Exécuter lysat par la voie SPE à un débit de 0,8 ml / h. </li><li> Laver le canal SPE avec 100 ul d&#39;éthanol à 70%, suivie par l&#39;éthanol à 100% of100 ul à 1 ml / h. (Il ya un volume de 50 ul morts dans l&#39;embout de la seringue qui ne sera pas expulsé, donc en fait seulement 50 ul traverse le canal.) </li><li> Positionner une seringue vide à la marque de 0,5 ml et pousser l&#39;air à travers le canal pour le sécher à 1 ml / h. </li><li> Exécuter 67,5 ul exempte de nucléase eau dans le canal pour éluer les acides nucléiques liés à raison de 0,5 ml / h, et de recueillir 13,5 ul de la nanoport au port déchets. (La perte de fluide est due à la 54 pl volume mort dans l&#39;embout de seringue et le canal SPE.) </li></ol> 3. RT-PCR <ol><li> Préparer 36,5 ul du mélange de RT-PCR maître au cours de l&#39;étape de l&#39;air sec (2,12) en utilisant les réactifs dans un OneStep de Qiagen kits de RT-PCR. </li><li> Chargez RT-PCR réactif dans le nanoport au port des déchets, et mélanger avec de l&#39;ARN pour obtenir le suivant 50 pl RT-PCR: 13,5 ul d&#39;ARN élués dans l&#39;eau sans nucléase, 4 pl RT-PCR mélange d&#39;enzymes, 10 ul de solution Q, 10 μl1X une tampon étape, 2 pl 25 mM MgCl 2, 1 pi 50 pM amorce 5&#39;-GAC TCC ARC TGT CAC CTC TGA C-3 &#39;, 1 uM d&#39;amorce 50 pi inverse 5&#39;-GCA ATS AGG TGG ACA AAK CGT CTA-3 &#39;, 2 ul de dNTP, 0,75 ul 1,0% p / v de BSA, 0,73 et 5,02 ul PEG8000 eau nucléase ul libre. </li><li> Chargez le mélange de RT-PCR dans le canal par RT léger vide (nous avons utilisé le vide du mur) et sceller le Nanoport avec un raccord fermé. </li><li> Appliquer 35 V pour chauffage 1. Conserver les réactifs dans le canal température ambiante pendant 30 min après le chauffage 1 s&#39;équilibre à 50 ° C. Conserver les réactifs dans le canal TA pendant 15 min après les 1 chauffe s&#39;équilibre à 95 ° C. </li><li> Appliquer 27 V pour chauffage 1 et 50 V pour chauffage 2, attendez environ trois minutes ou jusqu&#39;à ce réchauffeur 1 s&#39;équilibre à 60 et deg; C et chauffe 2 s&#39;équilibre à 95 ° C. </li><li> Poussez les réactifs dans le canal de PCR de 0,5 l / min. Il devrait prendre environ 20 minutes pour les réactifs de circuler à travers le canal en serpentin. </li><li> Que l&#39;échantillon qu&#39;il apporte à l&#39;extrémité du canal en serpentin, de recueillir les produits de la PCR à la sortie à l&#39;aide d&#39;une pipette à pointe et de taille appropriée. </li></ol> 4. PCR Détection Produits <ol><li> Nous utilisons un test de Agilent Haute Sensibilité ADN pour détecter les produits. Pour exécuter ce test sortir le kit Agilent ADN à haute sensibilité du réfrigérateur 30 min avant le test. </li><li> Allumez le bioanalyseur et ouvrez le logiciel expert 2100. </li><li> Chargez le pl 1 des produits de PCR dans le dépistage et le suivi du protocole d&#39;Agilent ( <a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">20Manual.pdf% http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent</a> ). </li><li> Analyser et enregistrer les données. </li></ol>

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Les auteurs ont déclaré aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

La méthode de diagnostic présenté ici a démontré la capacité d&#39;une puce microfluidique intégré en plastique pour amplifier l&#39;ARN de la grippe A partir d&#39;échantillons de patients avec une haute spécificité et une limite de détection plus bas depuis 13 Nous avons conçu cette puce pour le point de potentiel des tests précaution:. (A) la température et fluidique de contrôle ont été simplifiées, (b) la puce est peu coûteux et convenant à la fabrication à haut débit utilisant le m...

Des millions de décès ont été rapportés au cours des trois pandémies de grippe du 20e siècle 1. En outre, la pandémie de grippe la plus récente a été déclarée par l&#39;Organisation mondiale de la Santé (OMS) 2 en 2009, et à partir de Août 1, 2010, 18 449 décès ont été signalés par l&#39;OMS 3. Cette pandémie a démontré encore une fois la forte charge de maladies infectieuses, et la nécessité d&#39;une détection rapide et précise de la grippe pour permettre la confirmation des maladies rapide, appropriée réponse de santé publique et un traitement efficace 4. Il existe plusieurs méthodes couramment utilisées pour le diagnostic de la grippe, il s&#39;agit notamment de tests immunologiques rapides et directs tests immunofluorescence (DFAE) et les méthodes de culture virale. Immunoessais rapides considérablement manquent de sensibilité 5-8, tandis que les deux autres méthodes sont de main-d&#39;œuvre et de temps 9. Les tests moléculaires offrent de multiples avantages, y compris un demi-tour peu de temps, SENSIT hauteivité, et une plus grande spécificité. Plusieurs entités commerciales ont travaillé à des tests moléculaires rapides (également appelés tests des acides nucléiques ou des NAT) pour les maladies infectieuses, et plusieurs ont des tests de la grippe dans leurs pipelines. Cependant, la plupart d&#39;entre eux nécessitent la préparation d&#39;échantillons hors puce. Aucun des amendements Clinical Laboratory Improvement (CLIA) a renoncé à des tests moléculaires incorporer la préparation des échantillons d&#39;essai dans la cartouche ou module. Lab-on-a-chip technologie joue un rôle important dans le développement de dispositifs de contrôle de point de soins. Après l&#39;introduction de la première puce PCR en 1993 10, de nombreux efforts ont été consacrés au développement nucléiques puces de test d&#39;acide. Cependant, seuls quelques-uns d&#39;entre eux ont intégré la préparation des échantillons brut avec une amplification en aval. Nous avons précédemment démontré la miniaturisation d&#39;une colonne d&#39;extraction en phase solide (SPE) dans une puce microfluidique en plastique 11 et la mise au pointment et l&#39;optimisation d&#39;une puce PCR à flux continu 12. Ici, nous étendons les travaux antérieurs d&#39;intégrer la SPE avec RT et la PCR en une seule puce pour les diagnostics cliniques et démontrer sa capacité à amplifier les acides nucléiques de patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 1-dodécanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2,2-diméthoxy-2-phénylacétophénone </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 196118-50G </td></tr><tr><td> 2100 Bioanalyzer </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 19516 </td></tr><tr><td> Benzophenone </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 239852-50G </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA </td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td> Le méthacrylate de butyle </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 235865-100 ml </td></tr><tr><td> ARN entraîneur </td&gt; <td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 1017647 </td></tr><tr><td> Cyclohexanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> E7023 </td></tr><tr><td> Le diméthacrylate d&#39;éthylène </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 335861 </td></tr><tr><td> Diméthacrylate d&#39;éthylène glycol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 335681-100ML </td></tr><tr><td> Seringue en verre 250 pi </td><td> Hamilton, Reno, NV </td><td> 81127 </td></tr><tr><td> Le thiocyanate de guanidine </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 50981 </td></tr><tr><td> Haute Sensibilité Kit ADN </td><td> Agilent Technologies, Santa Clara, CA </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Presse à chaud </td><td> Carver, Wabash, IN </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JB Weld Epoxies </td><td> Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td> Luer-Lok seringues </td><td> BD-médicale, Franklin Lakes, NJ </td><td> 309628 </td></tr><tr><td> Chlorure de magnésium </td><td> Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA </td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td> Méthanol </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 494437 </td></tr><tr><td> Le méthacrylate de méthyle </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> M55909 </td></tr><tr><td> Nanoport </td><td> Upchurch Scientific </td><td> N-333-01 </td></tr><tr><td> Montage Nanoport </td><td> Upchurch Scientific </td><td> F-120x </td></tr><tr><td> Nucléase sans eau </td><td> Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA </td><td> PR-p1193 </td></tr><tr><td> OneStep RT-PCR kit </td><td> Qiagen, Valencia, CA </td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 41009 </td></tr&gt; <tr><td> Alimentation </td><td> VWR, Radnor, PA </td><td> 300V </td></tr><tr><td> RNase Away </td><td> Sigma-Aldrich, St. Louis, MO </td><td> 83931-250ML </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td> Applied Biosystems, Foster City, CA </td><td> AM7005 </td></tr><tr><td> Microsphères de silice </td><td> Polysciences, Warrington, PA </td><td> 24324-15 </td></tr><tr><td> Pompe à seringue </td><td> Harvard Apparatus, Holliston, MA </td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td> Bande thermiquement conductrice </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td> Thermocouple </td><td> Omega Engineering, Stamford, CT </td><td> 5SRTC-TT-J-40-36 </td></tr><tr><td> Couche mince chauffe </td><td> Minco, Minneapolis, MN </td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td> Crosslinker ultraviolet </td><td> UPV, Upland, CA </td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td> Zeonex </td> &lt;td&gt; Zeon Chemicals, Louisville, KY </td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

microfluidic chip fabrication and method to detect influenza

Diagnostics rapides et efficaces jouent un rôle important dans le contrôle des maladies infectieuses en permettant une gestion efficace des patients et le traitement. Ici, nous présentons une puce microfluidique intégré thermoplastique avec la capacité d&#39;amplifier le virus grippal A dans les patients nasopharyngé (NP) des tampons et des ponctions. Lors du chargement de l&#39;échantillon du patient, le dispositif microfluidique porte successivement sur la lyse des cellules sur puce, la purification de l&#39;ARN et des étapes de concentration au sein de l&#39;extraction en phase solide (SPE), la transcription inverse (RT) et la réaction en chaîne par polymérase (PCR) en RT-PCR chambres, respectivement. Point final de détection est réalisée à l&#39;aide d&#39;un Bioanalyzer hors puce (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Pour les périphériques, nous avons utilisé une pompe à seringue unique à conduire des réactifs et des échantillons, tandis que deux appareils de chauffage à couches minces ont été utilisés comme source de chaleur pour la RT et la PCR chambres. La puce est conçue pour être simple couche et adaptée pour la fabrication à haut débit pour réduire la fabricatile temps et le coût. La puce microfluidique offre une plateforme pour analyser une grande variété de virus et de bactéries, limitée seulement par des changements dans la conception des réactifs nécessaires à la détection de nouveaux agents pathogènes d&#39;intérêt.

<html> Un résultat typique est illustré à la figure 3 pour une grippe A spécimen infecté lavage nasopharyngé. En raison des quantités différentes de virus de la grippe dans chaque échantillon de patient, la concentration finale du produit de PCR est variable. Un bon résultat devrait avoir un faible bruit, deux pics échelle claires (35 et 10380 pb) et un pic seul produit à la taille du produit conçu (107 pb) pour l&#39;échantillon positif. Alors que le pic du produit devrait théoriquement ?...

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Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Une puce microfluidique intégré thermoplastique a été mis au point pour une utilisation comme diagnostic moléculaire. La puce effectue l&#39;extraction d&#39;acide nucléique, la transcriptase inverse et la PCR. Des procédés de fabrication et le fonctionnement de la puce sont décrits.

Fabrication puce microfluidique et méthode pour la détection de la grippe

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K vues.  Boston University. Une puce microfluidique intégré thermoplastique a été mis au point pour une utilisation comme diagnostic moléculaire. La puce effectue l'extraction d'acide nucléique, la transcriptase inverse et la PCR. Des procédés de fabrication et le fonctionnement de la puce sont décrits.

Vidéo: Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

Méthodes de détection par fluorescence pour les plateformes microfluidiques gouttelettes

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Recherche

Bio-ingénierie

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

Une puce microfluidique pour l&#39;analyse chimique polyvalente de cellules isolées

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabrication microfluidique de fibres polymères et biohybrides avec une taille et une forme redessinées

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

Une puce microfluidique pour ICPMS Présentation échantillon

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

Fabrication de dispositifs microfluidiques à base de papier en trois dimensions pour les immunoessais

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

Feuil sec axée sur la résine photosensible de biocapteurs microfluidiques électrochimiques plate-forme : Fabrication de dispositifs, préparation de dosage sur puce et fonctionnement du système

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabrication et Validation d’un système d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées à quantifier directement transendothéliale résistance électrique

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabrication évolutive d’étirable, Dual Channel, puces microfluidiques orgue

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...