Je m’appelle Dr Shankari Nair et je suis boursier postdoctoral à la Division de biophysique des rayonnements du département de médecine nucléaire de la NRF, iThemba LABS. Dans cette vidéo, nous démontrerons l’utilisation d’un test automatisé de foyers Gamma H2AX sur les lymphocytes du sang périphérique humain pour son utilisation dans des applications de symétrie par lots. Les risques radiologiques pour le personnel sont strictement contrôlés.
Les rayonnements ionisants affectent directement la structure de l’ADN en induisant des ruptures d’ADN. Particulièrement les ruptures double brin. L’une des premières étapes du processus de reconnaissance de la rupture double brin de l’ADN est la phospohorilisation de la variante des histones, H2AX, et le recrutement de protéines de réparation.
Cette vidéo décrira l’utilisation de la microscopie pour évaluer le nombre de foyers Gamma-H2AX à l’aide d’un système automatisé de balayage de lames et d’une plate-forme d’analyse, intégrant le microscope fluorescent. Les lymphocytes sont isolés du sang total. Diluer le sang total avec du PBS dans un rapport de un pour un, puis déposer doucement le sang dilué sur un volume de milieu de gradient de densité.
Superposez progressivement le sang en maintenant le tube incliné à 45 degrés. Transférer la suspension dans une centrifugeuse et tourner à température ambiante pendant 20 minutes à 900 G.Après centrification, quatre couches se formeront. Transférez soigneusement la couche trouble contenant les lymphocytes dans un nouveau tube conique stérile.
Lavez les lymphocytes avec du PBS et comptez à l’aide d’un hémocytomètre. Une fois le nombre total de lymphocytes déterminé, diluer le lymphocyte et la suspension à une concentration d’environ 800 000 lymphocytes dans un millilitre de RPMI complet. Les échantillons et sont prêts pour notre rayonnement.
Les lymphocytes sont irradiés avec des rayons gamma provenant d’une source de cobalt 60, puis incubés pendant une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone. Pour chaque condition d’irradiation ou tube, trois lames sont préparées. Placez le curseur dans le support du clip, suivi de la carte de filtre et enfin de l’entonnoir.
Fixez les clips de glissière et placez-les dans la cytocentrifugeuse. Ajouter 250 microlitres de la suspension cellulaire sur chaque entonnoir et tourner pendant 30 G pendant cinq minutes. L’utilisation de la cyto-centrifugeuse est essentielle pour obtenir des conditions standardisées sur l’automatisation des lames.
Une fois filés, retirez les diapositives du clip, puis à l’aide du stylo hydrophobe, dessinez un cercle autour de l’endroit où se trouvent les cellules. Maintenant que les lames ont été faites, les cellules doivent être fixées à la lame afin que la coloration immunofluorescente puisse se produire. Les cellules sont fixées à l’aide d’un paraformaldéhyde à 3%, ou PFA, et d’une solution de PBS pendant 20 minutes.
Après fixation, le lavage glisse dans un pot Coplin avec PBS pendant cinq minutes. Ensuite, couvrez les cellules avec Triton X pour permettre la perméabilisation. L’étape de perméabilisation élimine plus de lipides de la membrane cellulaire pour permettre aux anticorps de pénétrer à l’intérieur du noyau cellulaire.
À partir de là, nous utilisons une solution de blocage composée de 1% de BSA dans pbS, pour laver les lames afin de réduire la liaison non spécifique potentielle. Après trois étapes de lavage de 10 minutes avec 1% BSA et PBS, les lames sont incubées à température ambiante avec un à 500 anticorps primaires anti-gamma H2AX pendant une heure dans la chambre d’humidification, facilement accomplie en ajoutant du papier de soie humide à la base de la boîte de rangement rectangulaire. Après l’incubation avec un anticorps primaire, emboutir le liquide et laver à nouveau les lames dans une solution à 1% de BSA.
Incuber les lames avec un anticorps triTC anti-souris secondaire dilué d’un à mille ânes pendant une heure dans la chambre d’humidification. Retirez l’anticorps avant d’effectuer trois lavages de 10 minutes dans le PBS. Couvrez le pot Coplin dans du papier d’aluminium pour éviter toute exposition à la lumière pendant toute la durée des étapes de lavage.
Retirez les lames et essuyez l’excès de PBS à l’extérieur du cercle hydrophobe avec du papier de soie sans poussière. Enfin, ajoutez une à deux gouttes de DAPI pour obtenir un support de montage d’acquiesçage et couvrez doucement les glissières avec le couvercle. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées, puis conservez les échantillons dans un endroit sombre à quatre degrés centigrades pendant la nuit.
Essuyez délicatement les lames avec un éthanol à 70% et placez les lames sur la plate-forme de numérisation automatisée, ou l’étage de diapositive, attaché au microscope ZED-2 à images axiales zite. Sélectionnez la configuration de classification sous l’onglet MetaCyte pour modifier le classificateur. Le classificateur sélectionné sera utilisé par le système pour numériser et noter les diapositives, et est basé sur un ensemble de paramètres prédéfinis, qui détermineront comment le système sélectionne les cellules et les foyers de scores.
Le classificateur peut être optimisé et entraîné en fonction d’un certain nombre de champs d’image préclassifiés. Selon le grossissement du microscope, le type d’anticorps utilisés pour la coloration, un classificateur différent peut être optimisé. Par conséquent, les classificateurs varient généralement d’un laboratoire à l’autre, mais nous donnerons un aperçu des étapes les plus élémentaires à prendre en compte lorsqu’une configuration de classificateur doit être ajustée.
Sous l’onglet Capture' on peut trouver le filtre qui sera utilisé, ici DAPI et TRITC, avec un temps d’intégration maximum de 1,04 seconde. Ce dernier est basé sur le classificateur original fourni par la société et ajusté ultérieurement pour l’intensité de l’anticorps et le signal gamma de fond H2AX, ou TRITC, dans ce type de cellule spécifique, à savoir les lymphocytes. Sous l’onglet Exposition, le temps d’intégration minimum est défini.
Le classificateur restera toujours dans le temps d’intégration minimum et maximum, ce qui empêche la surexposition ou la sous-exposition de la diapositive. Sous l’onglet Sélection de cellule, les zones d’objet minimales et maximales ont été définies en fonction de la taille et de la forme des cellules analysées. Par exemple, la valeur de concavité prédéterminée et le rapport d’aspect sont spécifiques aux lymphocytes, qui ont généralement des formes rondes.
Sous l’onglet Fonctionnalités, vous pouvez modifier la vue de la galerie et de l’histogramme, ainsi que déterminer ce que le microscope doit marquer. Le système peut marquer de nombreux éléments, en fonction des fonctionnalités sélectionnées par l’utilisateur. Un exemple est le seuil de la façon dont le logiciel marque des objets individuels.
Une fois qu’un classificateur approprié a été identifié, sélectionnez la configuration dans la barre latérale et donnez à chaque diapositive un nom unique, suivi de la sélection du classificateur approprié. Sélectionnez Nombre maximal de cellules et ajoutez le nombre maximal de cellules à analyser. La recherche est terminée même si la fenêtre de recherche sélectionnée n’a pas encore été complètement analysée, dès que le nombre maximal de cellules est atteint.
Pour les applications de bio-dissymétrie, la notation automatisée de 1000 cellules par lame est suffisante, étant donné que trois lames par échantillon de sang sont préparées. Cliquez sur OK’pour confirmer les paramètres. Pour numériser les diapositives, sélectionnez Rechercher dans la barre latérale.
Si le paramètre Fenêtre de recherche manuelle a été sélectionné dans la configuration de la diapositive, une boîte de dialogue ouvre une ligne pour déterminer la zone de numérisation. En utilisant l’objectif 10 fois, la zone de recherche rectangulaire de la diapositive est sélectionnée de manière interactive en fixant deux coins du champ de recherche par un clic gauche de la souris. Cela peut être confirmé avec le bouton OK.
Ajustez la position de début de la mise au point. Le logiciel demandera une mise au point et centrera un noyau de référence en utilisant l’objectif 40 fois pour chaque diapositive et confirmera les paramètres avec OK. Le système se déplacera automatiquement de tous les côtés séquentiellement. Si nécessaire, ajustez la configuration de l’image en direct et le temps d’intégration pour cette étape.
Vérifiez tous les paramètres du microscope. Assurez-vous que le levier du tube du microscope est dans une position qui détourne toute la lumière vers la caméra et confirmez l’invite du système avec OK. Le système démarre la mise au point automatique de la grille à la position de grille la plus proche du champ de référence. Il continue de concentrer le champ sur la grille régulière, se déplaçant dans un méandre vers l’avant et l’arrière de la fenêtre de recherche.
L’analyse commence lorsque la mise au point automatique de la grille est terminée. La scène est déplacée dans un motif de méandre champ après champ pour capturer des données. Lorsqu’une cellule est détectée, elle est positionnée et l’image de la galerie est stockée et affichée à l’écran et le nombre de cellules est mis à jour.
La recherche est terminée si toute la recherche a été analysée, si le nombre maximal de cellules a été atteint ou si la recherche a été annulée. Une fois l’analyse terminée, cliquez avec le bouton droit de la souris sur la barre en bas et ouvrez un échantillon. Passez en revue la galerie, qui se compose de petites images de cellules détectées.
Dans cette fenêtre, vous pouvez spécifier les cellules stockées dans la galerie via un critère à choisir dans le menu déroulant. Les cellules sont généralement affichées dans l’ordre dans lequel elles ont été détectées. Cliquez sur Histogramme de qualité 'ou Diagramme de valeur de caractéristique' pour donner la distribution des cellules détectées, ainsi que les moyennes, et l’écart-type des foyers notés.
Ici, nous comparons les échantillons de gris zéro par rapport à 1,5 échantillon de gris. Il s’agit généralement d’une lame de contrôle, avec une valeur moyenne de 0,124 foyer par cellule, où la cellule n’a pas été irradiée. Dans un contexte de biodistymétrie, cela indiquerait qu’une personne n’a pas été exposée à un rayonnement à forte dose.
Dans le graphique, nous pouvons voir que la majorité des cellules ont presque zéro foyer par cellule, et il n’y a pas de côté de la distribution normale. Lorsque nous comparons cela à une dose de 1,5 gris, on peut clairement voir qu’il s’agit d’un échantillon irradié. Dans un contexte de bio-dissymétrie, cette distribution normale est un signe clair que l’échantillon a été exposé à des radiations.
Le balayage automatisé est suffisamment sensible pour détecter les foyers induits à faibles doses. Les résultats montrent une nette augmentation linéaire du nombre de foyers par cellule avec la dose. La méthode automatisée de détection de rupture double brin d’ADN est utile pour les applications de dyssymétrie biologique rapides et à haut débit.
Merci d’avoir regardé.
