Ce protocole nous permet d’isoler les lymphocytes T des patients atteints de la maladie pour des études, le défaut moléculaire et le défaut immunologique. Cette méthode nous permet d’isoler des cellules viables, des cellules présentant des anomalies de la maladie pour la purification de l’ARN, de l’ADN et des protéines de ces patients et qui nous permet de caractériser les défauts moléculaires pour comprendre les anomalies des voies qui sont importantes dans la pathogenèse. Cette méthode est précieuse pour l’isolement du sang périphérique qui peut être fractionné davantage pour étudier les cellules sanguines dans des états normaux, ainsi que les cellules sanguines de maladies présentant des anomalies immunitaires.
Alanna, qui est une étudiante en médecine de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Après avoir obtenu un échantillon de sang périphérique dans cinq tubes de 10 millilitres contenant de l’anticoagulant, transférer 10 à 15 millilitres de sang dans des tubes de séparation de 50 millilitres étiquetés avec le numéro de sujet et diluer les échantillons au moins deux fois, mais pas plus de 35 millilitres par tube avec HBSS. Sous-couchez soigneusement et lentement le sang avec environ 13 millilitres de milieu de densité par tube, arrêtant le pipetage lorsque la pipette est presque vide pour éviter les bulles.
Retirez la pipette lentement pour éviter de mélanger les couches de sang et de milieu de densité et transférez soigneusement les tubes de séparation remplis à la centrifugeuse sans perturber les couches. Après avoir séparé les cellules par centrifugation, retirez tous les 10 derniers millilitres de la couche supérieure contenant du plasma, sauf les 10 derniers, avant de recueillir soigneusement et lentement la couche de buffy. Regrouper la couche de buffy entre deux tubes de séparation dans un seul tube stérile de 50 millilitres étiqueté et diluer le PBMC au moins deux fois avec du HBSS frais pour un total de 50 millilitres par tube.
Lorsque toutes les couches de buffy ont été collectées, abattez les cellules par centrifugation et retirez autant de surnageant que possible de chaque tube. Tapotez le fond du tube pour desserrer la pastille et remettez en suspension les pastilles dans un à deux millilitres de tampon de lyse ACK par volume d’échantillon de sang original de 10 millilitres par tube. Après exactement cinq minutes, arrêtez la lyse dans chaque tube avec un volume égal ou supérieur de HBSS et réglez chaque volume à 50 millilitres.
Après la centrifugation, jeter le surnageant, regrouper les cellules du même donneur et porter le volume à 50 millilitres avec du HBSS frais pour une autre centrifugation. Ensuite, remettez en suspension les cellules dans 10 millilitres de milieu RP 10F de 37 degrés Celsius pour le comptage. Pour la purification des lymphocytes T CD4+CD45RO+, faites tourner les cellules et diluez le PBMC à une concentration de tampon de sélection de cinq fois 10 à sept cellules par millilitre.
Transférer les cellules dans un tube de polystyrène à fond rond de cinq millilitres et ajouter 50 microlitres de cocktail d’anticorps par millilitre d’échantillon avec un mélange doux. Après cinq minutes à température ambiante, vortex de particules magnétiques à grande vitesse pendant 30 secondes avant d’ajouter 50 microlitres de particules magnétiques par millilitre d’échantillon au tube avec un mélange doux. Porter le volume à 2,5 millilitres avec un tampon de sélection frais et un mélange doux et placer le tube sur un aimant pendant 2,5 minutes.
À la fin de l’incubation, ramassez l’aimant et inversez le tube en un mouvement continu pour décanter la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube stérile. Pour augmenter la récupération cellulaire, ajoutez 2,5 millilitres de tampon de sélection au tube sans perturber les billes immobilisées pour une autre incubation de 2,5 minutes sur l’aimant et ajoutez le lavage au tube de collecte, puis comptez le nombre de cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et confirmez la pureté cellulaire par cytométrie en flux. Pour activer les cellules, ajustez les lymphocytes T CD4+CD45RO+à une concentration moyenne de 37 degrés RP 10F de cinq fois 10 à 10 cellules par millilitre et ensemencez les cellules sur des boîtes de culture de taille appropriée.
Reposez les cellules dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit. Le lendemain matin, prélever les cellules reposées par centrifugation et remettre en suspension la pastille à une concentration moyenne de cinq fois 10 à 10 à la sixième cellule par millilitre de 37 degrés Celsius RP 10F. Divisez la suspension en cinq à 10 fois 10 à la sixième aliquote de cellule dans chacun des trois tubes stériles à bouchon à vis et stimulez les cellules dans le tube deux avec PMA et le tube trois avec A23187 et mélange doux.
Ajouter un volume égal de diméthylsulfoxyde au premier tube servant de commande du véhicule et placer les tubes avec les bouchons desserrés dans l’incubateur pendant la période d’activation appropriée. À la fin de l’incubation, prélever les cellules par centrifugation et jeter autant de surnageant que possible sans perturber la pastille cellulaire. Ensuite, lysez les cellules comme indiqué par un kit d’isolement d’ARN disponible dans le commerce et isolez l’ARN selon les instructions du fabricant.
La viabilité et la pureté des lymphocytes T CD4+CD45RO+obtenus par ce protocole de sélection négative sont constamment élevées. Le rendement des lymphocytes T CD4+CD45RO+obtenus à partir des chambres du système de leucoréduction des PBMC SS est généralement d’environ 75 % par rapport à environ 16 % des PBMC de donneurs normaux. Les lymphocytes T à mémoire SS et les PBMC SS ont mal exprimé la cytokine et d’autres gènes de réponse immunitaire par rapport aux cellules des lymphocytes T et des PBMC de donneurs normaux.
En outre, de nombreux gènes qui ne sont normalement pas exprimés dans les lymphocytes T donneurs normaux sont fortement exprimés dans les lymphocytes T SS à la fois au repos et après stimulation. Une bonne technique stérile et une routine cohérente sont vraiment importantes pour le succès de cette technique. Il est également très important pendant que vous superposez le Ficoll que vous utilisiez une pipette automatique avec un contrôle fin et que vous fassiez vraiment attention à la vitesse à laquelle vous posez le Ficoll.
Les cellules isolées à l’aide de cette méthode seront viables et pourront être utilisées pour des études de toxicité, des études biochimiques moléculaires pour la caractérisation des voies de transduction du signal, la cytométrie en flux et les études d’expression génique. La méthode peut être utilisée pour isoler les cellules des patients atteints de maladies, pour les maladies inflammatoires, et aussi d’autres maladies telles que les cancers pour des études directes. Des exemples de ces maladies comprennent le psoriasis et la dermatite atopique.
