Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement des protéines de réparation par coloration d’immunofluorescence dans les lignées humaines de cellules cancéreuses du côlon après irradiation avec le faisceau neutronique-mélangé. L’imagerie par immunofluorescence est une méthode sensible et fournit des preuves visuelles de l’apparition de protéines de voie de réparation dans les foyers en réponse aux agents nuisibles à l’ADN, comme le rayonnement ionisant. Le faisceau mixte de neutrons est utilisé dans la thérapie de capture neutronique du bore, le BNCT, et la réponse aux dommages causés par la radiation de l’ADN n’a pas été entièrement établie.
Notre protocole peut également être utile pour l’analyse des effets biologiques au niveau cellulaire en raison du rayonnement par d’autres faisceaux à haute teneur en LET, comme les protons utilisant la protonthérapie ou les ions de carbone utilisant la thérapie de hadron. Après l’irradiation, retirer le milieu des cellules attachées et les laver une fois avec 2,5 millilitres de PBS. Puis fixer les cellules avec un millilitre de 70% d’éthanol pendant 10 minutes.
Pour perméabiliser les cellules, retirez l’éthanol et lavez-les avec 2,5 millilitres de PBS. Ajouter délicatement un millilitre de 2%Triton X-100 dans PBS pour couvrir les coverslips, et incuber les cellules pendant cinq minutes à température ambiante. Lavez les cellules trois fois avec PBS, et bloquez la perméabilisation avec un millilitre de 2%BSA dilué dans PBS.
Ensuite, incuber les cellules pendant un minimum de 30 minutes avec le BSA 2%. Pour tacher les cellules, ajoutez la quantité appropriée d’anticorps primaire dilué dans PBS avec BSA, comme recommandé dans le manuscrit de texte. Couvrez ensuite la boîte de Pétri et placez-la dans une boîte en plastique avec de la lignine hydratée pour maintenir l’humidité.
Incubez-le pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, effectuer trois lavages avec PBS, et ajouter la quantité appropriée d’anticorps secondaires. Remettre le plat dans la boîte en plastique avec de la lignine hydratée et l’incuber pendant au moins 30 minutes à 37 degrés Celsius.
Répétez ensuite les lavages avec PBS, et ajoutez 100 microlitres de DAPI dilués à une concentration finale d’un microgramme par millilitre pour contrestain les noyaux. Incuber les cellules pendant un maximum de deux minutes à température ambiante, et répéter les lavages avec PBS. Après le dernier lavage, retirer le PBS, et mettre doucement un coverslip sur le dessus du milieu de montage, en évitant la formation de bulles d’air.
Sceller les bords du coverslip avec du vernis à ongles et laisser durcir le milieu de montage avant d’effectuer une microscopie de fluorescence. Les foyers Gamma-H2AX, qui sont des marqueurs standard pour les ruptures à double brin d’ADN, ont été détectés dans des cellules cancéreuses du côlon mélangées à neutrons, irradiées par faisceau et non irradiées. Les foyers apparaissent sous forme de points fluorescents distincts.
Un diamètre plus élevé des foyers gamma-H2AX a été observé dans les cellules irradiées. En outre, une seule piste d’une particule alpha à haute teneur en LET a été détectée traversant les noyaux. La microscopie d’immunofluorescence a été employée pour détecter les protéines représentatives de réparation Rad52 et la kinase de protéine ADN-dépendante.
Une valeur moyenne élevée du diamètre de foyer de kinase protéine dépendante de l’ADN a été mesurée aux ruptures d’ADN après irradiation par rapport aux cellules de contrôle. Des ruptures à double brin d’ADN groupées ont été observées dans les cellules irradiées comme des foyers plus complexes, plus grands et groupés avec une intensité plus élevée. L’étape la plus importante de la coloration par immunofluorescence est la fixation des cellules et la perméabilisation de la membrane cellulaire.
Ces étapes sont nécessaires pour permettre aux anticorps de pénétrer facilement à la fois dans ces cellules et les protéines de réparation intracellulaires. Cette procédure donne des informations sur l’activation de chaque voie de réparation au niveau cellulaire. Les résultats devraient ensuite être confirmés au niveau moléculaire à l’aide d’un test, tel que pcr en temps réel.
Cette technique permet aux chercheurs d’explorer la réponse aux dommages causés par la radiation de l’ADN, qui n’a pas été entièrement déterminée dans le cas de différents faisceaux utilisant des thérapies anticancéreuses.
