Les macrophages tumeur-associés jouent des rôles importants dans le microenvironnement de tumeur. Comprendre comment différentes mutations génétiques dans les cellules tumorales affectent le recrutement de macrophages est essentielle pour concevoir un traitement personnalisé pour les patients atteints de cancer. Cet essai fournit un moyen facile et robuste d’évaluer l’interaction entre les cellules tumorales et les macrophages in vitro.
Cet essai peut être modifié pour évaluer les interactions entre les cellules tumorales et d’autres cellules immunitaires in vitro. Pour commencer cette procédure, réchauffez le milieu de cellules souches sans sérum en le plaçant dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Vaporiser la surface du capot de culture tissulaire avec 70% d’éthanol et essuyer la surface pulvérisée avec des serviettes en papier.
Ensuite, vaporisez les bouteilles de solution de détachement moyen et cellulaire avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec des serviettes en papier. Transférer les bouteilles nettoyées dans le capot de culture tissulaire. Récupérer la cellule tumorale et la transférer dans le capot de culture tissulaire.
Aspirer le milieu et laver les cellules avec 10 millilitres de PBS. Ajouter ensuite deux millilitres de solution de détachement cellulaire à la fiole. Placez le flacon dans le capot, en vérifiant chaque minute pour voir si les cellules tumorales se sont arrondies.
Une fois que les cellules tumorales arrondir, appuyez doucement sur le côté de la fiole pour aider les cellules à se détacher. Après cela, pipette huit millilitres de milieu cellulaire sans sérum dans le flacon et pipette de haut en bas trois fois pour mélanger. Transférer cette suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et une centrifugeuse à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirez le surnatant. Ensuite, lavez les cellules en 10 millilitres de PBS, en s’assurant de pipette de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger. Centrifuger les cellules à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules en 10 millilitres de milieu sans sérum. Pipette de haut en bas trois à cinq fois pour mélanger. Mélangez 10 microlitres de cette suspension cellulaire avec 10 microlitres de solution Trypan Blue.
Pipette suivante 10 microlitres du mélange Trypan Blue et cellulaire dans une diapositive de comptage, et utiliser un compteur de cellules automatiques pour quantifier le numéro de cellule vivante. Utilisez un milieu cellulaire sans sérum pour ajuster la densité cellulaire à 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre. Puis ensemencer deux millilitres des cellules dans chaque puits d’une plaque de culture de six puits.
En même temps, préparez six puits avec seulement deux millilitres de milieu de cellules souches sans sérum. Après cela, incuber les plaques de six puits à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Vaporisez d’abord la surface du capot de culture tissulaire avec 70 % d’éthanol et essuyez la surface pulvérisée avec des serviettes en papier.
Ensuite, vaporisez les bouteilles de solution de détachement moyen et cellulaire avec 70% d’éthanol et essuyez-les avec des serviettes en papier. Transférer les bouteilles nettoyées dans le capot de culture tissulaire. Après cela, récupérer les plaques de six puits de l’incubateur.
Pipette soigneusement le média conditionné dans des tubes de centrifugeuse stériles de 15 millilitres, et placez les tubes sur la glace. Ajouter 0,5 millilitres de solution de détachement cellulaire dans chaque puits des plaques de six puits, et vérifier chaque minute si les cellules tumorales ont arrondi. Une fois que les cellules tumorales arrondir, appuyez doucement sur le côté de la plaque pour aider à détacher les cellules.
Pipette suivante 2,5 millilitres de milieu d’entretien des cellules tumorales dans le puits et pipette de haut en bas trois fois pour mélanger. Transférer les cellules dans un tube de centrifugeuse stérile de 15 millilitres. Mélanger 10 microlitres de cellules avec 10 microlitres de la solution Trypan Blue, et transférer 10 microlitres de ce mélange dans la diapositive de comptage.
Utilisez un compteur de cellules automatiques pour quantifier le nombre de cellules vivantes et utilisez le milieu de cellules souches sans sérum qui a été incubé à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour ajuster le volume des médias conditionnés en fonction du numéro de cellule. Filtrer le média conditionné à travers des filtres de 0,45 micromètre et placer les supports conditionnés sur la glace. Pour commencer, réchauffer le milieu IMDM dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.
Nettoyez le capot de culture tissulaire avec 70% d’éthanol et nettoyez la bouteille de milieu et transportez-la dans le capot comme décrit précédemment. Ensuite, transférez la fiole des cellules MV-4-11 dans le capot. Pipette 10 millilitres de cellules dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres.
Utilisez Trypan Blue et un compteur de cellules automatique pour quantifier le nombre de cellules vivantes comme décrit précédemment. Puis centrifuger les cellules à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant et laver les cellules avec 10 millilitres de PBS.
Centrifugeuse à nouveau à 200 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Aspirer le supernatant, et resuspendre les cellules dans le milieu IMDM à une densité cellulaire finale d’un million de cellules par millilitre. Apportez d’abord les matériaux nécessaires à la température ambiante.
Ajouter 250 microlitres des cellules MV-4-11 préparées à chaque insert. Ajouter ensuite 400 microlitres du milieu conditionné ou moyen seulement aux chambres inférieures de la plaque de 24 puits, en s’assurant d’ajouter les échantillons en triplicate. Incuber à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant quatre heures.
Puis appuyez doucement sur l’insert sur la paroi intérieure du même puits et jetez l’insert. Pipette doucement les cellules dans les puits de haut en bas trois fois pour mélanger. Transférer 225 microlitres de cette suspension cellulaire dans les puits d’une plaque à parois noires de 96 puits adaptée à la mesure fluorescente.
Après cela, diluer le colorant CyQUANT avec tampon 4x lyse à un rapport de un à 75. Vortex brièvement et spin down la solution. Transférer 75 microlitres de cette solution à chaque puits de la plaque de 96 puits et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
À l’aide d’un lecteur de plaque de fluorescence, lisez la fluorescence et analysez les données décrites dans le protocole textuel. Dans cette étude, un essai in vitro est employé pour étudier l’interaction de macrophage de tumeur. Les échantillons ayant des valeurs élevées de fluorescence indiquent que le média conditionné a une grande capacité de recruter des macrophages.
Selon les besoins expérimentaux, des contrôles supplémentaires peuvent être inclus. Par exemple, on peut utiliser des anticorps neutralisants pour traiter les médias conditionnés pour abolir la chimiotaxis macrophage et effectuer de la même manière. On peut également ajouter des chimiokines supplémentaires aux médias conditionnés, qui servent de contrôle positif.
Il est important de contrôler les différences de nombre de cellules pour cet essai parce que différents types de cellules peuvent se développer à des vitesses différentes. La confirmation in vivo des résultats in vitro est essentielle. On peut injecter des cellules tumorales dans les souris et analyser les tumeurs avec la cytométrie d’écoulement, l’immunostaining, et CyTOF pour confirmer les résultats.
