Ce protocole est important car il permet d’étudier le système glymphatique chez un grand mammifère, nous rapprochant ainsi de la compréhension du système glymphatique chez l’homme. Cette technique présente deux avantages. L’introduction de traces dans la cisterna magna évite tout dommage direct au cerveau, ce qui contraste avec les injections intraventriculaires.
Deuxièmement, il s’agit d’une approche directe qui permet une visualisation immédiate de la canulation et de savoir si elle a réussi ou non. Commencez par placer le cochon dans une position couchée. Palper l’arrière de sa tête et de son cou pour localiser et marquer la crête occipitale, la colonne vertébrale des premières vertèbres thoraciques et la base de chaque oreille.
Tracez une ligne droite entre la crête et les vertèbres le long de l’axe longitudinal. Ensuite, en suivant la base du crâne, tracez deux lignes de la crête à la base de chaque oreille. Serrez soigneusement la queue de l’animal et surveillez un réflexe pour voir s’il est dans un sommeil profond.
Commencez par faire une incision cutanée le long de la ligne longitudinale jusqu’au muscle à l’aide d’un scalpel avec une lame numéro 21, puis étendez deux incisions perpendiculaires plus loin le long des épaules, chacune de 10 à 15 centimètres de longueur. En partant de la crête occipitale, faites des incisions cutanées le long de la ligne jusqu’à la base de chaque oreille. Utilisez des pinces anatomiques pour saisir les coins de la peau formés à la crête occipitale, puis passez légèrement la lame du scalpel sur le fascia pour séparer la peau du muscle sous-jacent.
Réséquez la peau le long de chacune des cinq incisions pour visualiser des parties du muscle trapèze. Utilisez le scalpel pour faire une incision longitudinale d’environ un centimètre de profondeur où le trapèze se réunit à la ligne médiane, puis effectuez une dissection émoussée le long de la coupe longitudinale dans les muscles à l’aide d’une combinaison de pinces chirurgicales droites et incurvées, qui sépareront le ventre du trapèze et le muscle biventeur semispinalis capitis sous-jacent. Coupez toutes les fibres musculaires persistantes avec un scalpel et continuez à effectuer une dissection contondante jusqu’à ce que le semispinalis capitis complexus devienne visible.
Déplacez-vous le long de l’aspect postérieur du crâne et coupez les origines des muscles biventeurs trapèze et semi-spinal capitis. Pour séparer les deux muscles longitudinalement, utilisez la pince chirurgicale pour effectuer une dissection contondante jusqu’à ce que le semispinalis capitis complexus soit entièrement visible. Utilisez ensuite les rétracteurs auto-retenants pour rétracter les muscles biventeurs trapèze et semi-spinal capitis.
Utilisez le scalpel pour faire une incision longitudinale d’un centimètre de profondeur où le ventre du semispinalis capitis complexus se réunit à la ligne médiane. Effectuez une dissection contondante à l’aide de pinces chirurgicales travaillant le long de la coupe longitudinale entre les ventres musculaires jusqu’à ce que l’atlas et l’axe soient palpables. Déplacez-vous le long de l’aspect postérieur du crâne, coupant les origines des muscles complexes de semispinalis capitis.
Utilisez le scalpel et la dissection contondante pour séparer le muscle longitudinalement des vertèbres sous-jacentes, puis utilisez un autre ensemble de rétracteurs auto-retenus pour rétracter les muscles complexes de semispinalis capitis. Utilisez un scalpel pour enlever soigneusement tout tissu restant recouvrant la région où l’atlas rencontre la base du crâne. Placez un bras sur le cou de l’animal et un doigt à la jonction de l’atlas et du crâne, puis soulevez simultanément la tête et fléchissez le cou tout en palpant avec le doigt pour révéler la cisterna magna.
Assurez-vous qu’une personne élève et fléchit la tête et le cou de l’animal pendant que l’autre palpe pour la cisterna magna, en notant son emplacement anatomique. Introduisez une canule de calibre 22 lentement et soigneusement dans la cisterna magna à travers la dure-mère à un angle oblique par rapport à l’axe longitudinal, puis rétractez l’aiguille de la canule et placez un capuchon sur la serrure. Commencez par appliquer de la super colle et un accélérateur où la canule pénètre dans le tissu, puis appliquez le ciment dentaire.
Attendez cinq minutes que le ciment durcisse. Retirez soigneusement le capuchon de la canule. Fixez la canule à l’extrémité mâle du robinet de ligne IV avec le traceur à l’aide d’une extension de 10 centimètres.
Injectez le traceur lentement à une vitesse de 100 microlitres par minute, soit à la main, soit à l’aide d’une micro-pompe à perfusion. Retirez le robinet de ligne IV et remplacez-le par le capuchon. Vérifiez si le traceur est visible en pulsation à la base de la canule.
Placez ensuite des sacs de sable sous le cou de l’animal pour maintenir une certaine flexion. Relâchez la tête et laissez l’animal dans une position couchée au repos. Relâchez les rétracteurs auto-retenants et remplacez les muscles.
Utilisez les pinces à serviette chirurgicale pour rapprocher la peau sur les muscles. Utilisez d’abord de la gaze, puis une couverture pour couvrir les pinces à serviette et l’incision pour limiter les pertes de chaleur. Laissez le traceur circuler pendant la durée souhaitée.
Des images macroscopiques cousues de la surface dorsale du cerveau peuvent fournir des informations détaillées sur les modèles de distribution du traceur à travers les sulci et les fissures. Des images similaires des surfaces ventrales et latérales du cerveau peuvent fournir des informations sur la distribution du traceur dans le lobe temporal et la fissure latérale. Des images de la surface du cerveau de grossissement plus élevé produites à l’aide d’un stéréoscope peuvent aider à visualiser le traceur dans le PVS le long des artères.
Les sections macroscopiques du cerveau coronal donnent un aperçu de la profondeur de pénétration du traceur dans la fissure interhémiosphérique et la distribution et la structure du traceur sous-cortical, comme l’hippocampe et le striatum. La coloration immunohistochimique de l’AQP4, de la protéine acide fibrillaire gliale et de l’actine musculaire lisse a montré que le traceur se localisait dans le PVS et se déplaçait dans le parenchyme cérébral. Les processus du pied astrocytaire qui forment la surface externe du PVS sont identifiés à l’aide de l’AQP4 et de la coloration acide fibrillaire gliale.
Les cellules endothéliales qui forment la surface interne du PVS sont colorées à l’aide de lectine et de tache GLUT-1. La coloration SMA identifie les artères et les artérioles et peut être utilisée pour montrer que l’afflux de PVS se produit le long des artères au lieu des veines, ce qui constitue la physiologie de base de la fonction glymphatique normale. À l’avenir, nous espérons explorer le système glymphatique à haute résolution chez les grands mammifères dans le contexte de la neuropathologie comme les accidents vasculaires cérébraux et les lésions cérébrales traumatiques.
