<p class="jove_content"&gt; Le travail des auteurs a été soutenue par une subvention de recherche ID-BOF 2006 du l&#39;Université d&#39;Anvers (accordé à la PPO et AVDL), par des subventions de recherche et G.0136.11 G.0130.11 (accordée à AVDL, ZB et PPO) et 1.5.021.09. N.00 (accordée à PPO) du Fonds de la Recherche Scientifique-Flandre (FWO-Vlaanderen, Belgique), par l&#39;OSK de subvention de recherche IWT-60838: BRAINSTIM de l&#39;Institut flamand pour la science et la technologie (accordée à ZB et AVDL), en partie par une subvention de recherche de Mathusalem, le gouvernement flamand (accordée à ZB), en partie par CE-FP6-NoE DiMI (LSHB-CT-2005-512146), CE-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) , et par le Polonais Inter Universitaire de sortie IUAP-NIMI-P6/38 (accordée à AVDL). Nathalie De Vocht titulaire d&#39;un doctorat-bourse d&#39;études de la FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts est un chercheur post-doctoral de l&#39;FWO-Vlaanderen.</p

1. Préparation des cellules <ol><li> Les expériences doivent être initiée à l&#39;aide de culture ex vivo des populations de cellules souches génétiquement modifiées pour exprimer des protéines rapporteur de la luciférase et eGFP. Ici, nous utilisons la luciférase / eGFP exprimant murins de moelle osseuse des cellules dérivées du stroma (BMSC-Luc/eGFP) tels que décrits précédemment par Bergwerf et al. 2, 5. </li><li> Deux jours avant le marquage cellulaire, les cellules BMSC-Luc/eGFP plaque à une densité de 8 x 10 5 cellules par flacon de culture T75 dans 15 ml d&#39;expansion à moyen complet (CEM) supplémenté avec 1 ug / ml. Puromycine </li><li> Laisser les cellules à croître pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Ajouter 5 x 10 6 glaciaires bleus de taille micronique des particules d&#39;oxyde de fer (GB MPIO) moyen par ml de culture à la culture cellulaire de plus en plus (total: 75 x 10 6 particules par 15 ml du milieu de culture dans un flacon T75 culture). </li><li> Incuber pendant 16 heures pour permettre l&#39;absorption de particules par endocytose. </li><li> Laver les particules restanteset permettent aux cellules de se développer pour une période supplémentaire de 24 heures pour obtenir une répartition cellulaire confluence et homogène de la MPIO Go. </li><li> Valider l&#39;absorption des particules visuellement en utilisant la microscopie par fluorescence en comptant le rapport de la EGFP + et GB MPIO + de cellules à la quantité totale de la EGFP + cellules. </li><li> Laver les cellules Go BMSC-Luc/eGFP MPIO-étiquetés à deux reprises avec 10 ml de PBS et les cellules de récolte à la suite de trypsine-EDTA de traitement (5 ml par flacon T75 culture pendant 5 minutes). </li><li> Laver les cellules récoltées et remettre en suspension à une concentration finale de 133 x 10 6 cellules / ml dans du PBS. </li><li> Gardez les cellules sur de la glace jusqu&#39;à la transplantation. </li></ol> 2. L&#39;implantation de cellules dans le SNC de souris <ol><li> Anesthésiez souris par une injection intrapéritonéale d&#39;une kétamine (80 mg / kg) + xylazine (16 mg / kg) mélange. </li><li> Attendre 5 minutes pour permettre à des souris à s&#39;endormir. </li><li> Rasage de la tête de la souris pour permettre les manipulations stériles. </li><li> Placez la souris dans un cadre stéréotaxique. </li><li> Désinfecter l&#39;la peau et les yeux mouillés de la souris pour éviter la déshydratation. </li><li> Faire une incision du cuir chevelu ligne médiane pour exposer le crâne, et percer un trou dans le crâne à l&#39;aide d&#39;une perceuse fraise dentaire aux coordonnées données: 2 mm en arrière et 2 mm latéralement à Bregma. </li><li> Vortex de la suspension cellulaire brièvement et aspirer la suspension cellulaire dans la seringue. </li><li> Placez l&#39;aiguille de seringue à une profondeur de 2,5 mm sous la dure-mère et permettre d&#39;équilibrage de pression pendant 1 minute. </li><li> Injecter une suspension à 3 cellules ul (4 x 10 5 cellules) à une profondeur de 2 mm sous la dure-mère et à une vitesse de 0,70 l / min en utilisant un système automatisé de micro-injection de la pompe. </li><li> Attendez 5 minutes supplémentaires pour empêcher le reflux de la suspension cellulaire injectée. </li><li> Lentement retirer l&#39;aiguille et à désinfecter les frontières de la peau avant de suturer la peau. </li><li> Injecter 300 ul solution NaCl 0,9% sous-cutanée afin d&#39;éviter la déshydratation, et placez la souris sous une lampe chauffante pour récupérer de l&#39;anesthésie. Administrer post-opératoire analgésique en conformité avec les normes institutionnelles. </li></ol> 3. Dans bioluminescence in vivo <ol><li> Anesthésier les souris par un mélange de 3% d&#39;isoflurane et l&#39;oxygène. </li><li> Placez la souris dans le Photon Imager et réduire le niveau de l&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane 1,5% et de l&#39;oxygène. </li><li> Injecter 150 mg D-luciférine par kg de poids corporel par voie intraveineuse. </li><li> Acquérir l&#39;image pendant 5 minutes en utilisant le logiciel Vision photo. </li><li> Effectuer le traitement d&#39;image en utilisant le logiciel M3vision. Quantifier le signal observé à l&#39;aide des régions d&#39;intérêt fixes. </li></ol> 4. Dans l&#39;imagerie par résonance magnétique in vivo <ol><li> Anesthésier les souris avec 3% d&#39;isoflurane dans un mélange de O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Placez la souris dans le dispositif de retenue d&#39;un système horizontal 9.4T MR et réduire le niveau de l&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane 1% dans un mélange de O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Mouiller les yeux des souris afin de prévenir la déshydratationtion, attacher une sonde rectale pour surveiller la température du corps et surveiller le taux de respiration en plaçant un capteur en dessous du ventre de la souris. </li><li> Maintenir le taux de respiration à 110 ± 10 respirations par minute et maintenir la température corporelle constante dans une fourchette étroite de 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Placer la bobine RF surface au-dessus de la tête de la souris et la position de la souris dans le milieu de l&#39;aimant. </li><li> Acquérir un ensemble de 10 coronales pondérées en T2 écho de spin (SE) des images pour obtenir des informations spécifiques à l&#39;anatomie et pondérées T2 * écho de gradient (GE) des images afin d&#39;étudier la migration de cellules souches avec une résolution dans le plan de 70 um 2. Définissez les paramètres de séquence comme suit: temps de répétition (TR): 500 ms, temps d&#39;écho (TE): 8 ms (séquence GE) et temps de répétition (TR): 4200 ms, temps d&#39;écho (TE): 12,16 ms (SE séquence); champ de vision (FOV): 18x18 mm 2, la matrice: 256x256, une épaisseur de 1 mm et 1 tranche de séparation tranche mm (5,1 Paravision logiciel). </li><li> Effectuer le traitement des donnéesutilisant Amira 4,0 logiciel. </li></ol> 5. Post Mortem Histologie <ol><li> Anesthésier les souris très profondément par l&#39;inhalation de l&#39;oxygène isofluorane (4%), (0,5 L / min) et de l&#39;azote (1 L / min) le mélange pendant 2 minutes. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale. </li><li> Retirez le cerveau de souris à partir du crâne et fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 2 heures. </li><li> Déshydrater les tissus du cerveau en plaçant le cerveau par la suite dans différents gradients de saccharose: 2 h dans 5% de saccharose dans du PBS, 2 heures dans du saccharose à 10% dans du PBS, pendant la nuit dans du saccharose à 20% dans du PBS. </li><li> Congeler le tissu cérébral utilisant de l&#39;azote liquide et stocker le tissu à -80 ° C jusqu&#39;à ce que la coupe. </li><li> Section du tissu cérébral dans 10 um d&#39;épaisseur à l&#39;aide des sections d&#39;un cryostat. </li><li> Écran souillé cryosections pour la fluorescence bleue des particules MPIO Go et de la fluorescence verte à partir des cellules exprimant eGFP l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence. </li><li> Écran souillé cryosections pourfluorescence de fond vert / rouge à partir de cellules inflammatoires. </li><li> Effectuer des colorations immunohistochimiques et plus immunofluorescence pour identifier les populations cellulaires endogènes (par exemple les microglies, les astrocytes, des cellules T, ...) qui interagissent avec des greffes cellulaires. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Nous avons ici présenté visuellement une séquence optimisée des événements pour l&#39;imagerie multimodale réussie de la luciférase / eGFP-populations de cellules exprimant (tige) dans le SNC de la souris. Dans un premier temps, les résultats décrits Go MPIO procédure de labellisation en matière d&#39;étiquetage très efficace des cellules BMSC-Luc/eGFP, qui peuvent facilement être validées en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 2A). Ensuite, au moment de greffage de Go MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP dans le SNC de la souris, la survie de la greffe cellulaire peut être contrôlée par in vivo BLI basée sur l&#39;activité luciférase (figure 2B). En outre, la localisation exacte des cellules greffées peuvent être surveillés par in vivo </em&gt; IRM basée sur la teneur en fer de l&#39;MPIO Go (figure 2C). Enfin, l&#39;analyse histologique permet de valider les résultats obtenus par BLI et de l&#39;IRM. La survie stable a été confirmé par une expression de l&#39;EGFP stable dans le temps (figure 2D). Pour cela, colocalisation des cellules exprimant eGFP avec bleu fluorescent MPIO permet la détermination exacte de la localisation et la survie des cellules greffées. En outre, ce double étiquetage fluorescent des cellules souches réduit la possibilité d&#39;observer des résultats faussement positifs basés sur la fluorescence de fond créé par les cellules inflammatoires 5. <img alt="Figure 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la séquence de traitement <ol class="lroman"><li> Marquage des cellules: BMSC-Luc/eGFP sont marqués avec 5 x 10 6 particules MPIO GB par ml du milieu de culture. Après 16 heures d&#39;incubation et une période de repos qui suit de 24 h, les cellules sont récoltées pourl&#39;implantation intracérébrale. </li><li> L&#39;implantation de cellules: GB MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP sont greffés dans le cerveau de la souris aux coordonnées suivantes: bregma -2 mm, 2 mm à droite de la ligne médiane et 2 mm sous-mère. </li><li> In vivo BLI: Après l&#39;administration intraveineuse de 150 mg D-luciferin/kg poids corporel, la lumière générée a été acquis pendant 5 minutes en utilisant le Photon Imager. </li><li> En IRM in vivo: Un ensemble de 10 coronales pondérées en T2 écho de spin (SE) et des images pondérées T2 * écho de gradient (GE) des images avec une résolution dans le plan de 70 um ont été acquis 2. Paramètres de la séquence étaient les suivants: temps de répétition (TR): 500 ms, temps d&#39;écho (TE): 8 ms (séquence GE) et temps de répétition (TR): 4200 ms, temps d&#39;écho (TE): 12,16 ms (séquence SE); champ de vision (FOV): 18x18 mm 2, la matrice: 256x256, une épaisseur de 1 mm et 1 tranche de la séparation coupe mm. </li><li> Post-mortem histologie: 10 microns d&#39;épaisseur Coupe à congélation ont été criblées pour eGFP exprimer et bleu marqué par fluorescence BMSC uchanter un microscope à fluorescence. </li></ol><img alt="Figure 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> Figure 2. Imagerie multimodale des greffes de cellules souches <ol class="ualpha"><li> Immunofluorescence directe des glaciaire bleu (GB) MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP. </li><li> In vivo BLI des souris injectées avec 4x10 5 Go MPIO a marqué les cellules BMSC-Luc/eGFP à la semaine 1 et semaine 2 après l&#39;implantation. L&#39;analyse statistique des signaux détectés BLI à la semaine 1 et semaine 2 post-implantation. Les données sont exprimées en nombre moyen de photons par seconde et par stéradian par centimètre carré (ph / s / sr / cm 2) à partir d&#39;une période de temps de 5 minutes + / - erreur-type calculée à partir d&#39;une région d&#39;intérêt fixe chez la souris montrant un signal clair BLI au niveau du site d&#39;injection. </li><li> Coronale à deux dimensions IRM de GB MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP (panneau de gauche: (i) en pondération T2 écho de spin et (ii) T2 *-image pondérée en écho de gradient) et non marqué BMSC-Luc / eGFP (panneau de droite: (iii) en pondération T2 écho de spin et (vi) T2 *-image pondérée en écho de gradient) des greffes dans le cerveau de la souris. </li><li> L&#39;analyse histologique de GB MPIO étiquetés implants BMSC-Luc/eGFP à la semaine 2 post-implantation. (I) l&#39;analyse immunofluorescence directe pour la localisation de eGFP exprimant et GB greffes MPIO BMSC-Luc/eGFP étiquetés. (Ii) les informations à fort grossissement de (i). (Iii) La coloration par immunofluorescence pour antigène GFAP, indiquant le développement de tissu cicatriciel astrocytaire dans les environs de Go MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP. (Vi) La coloration par immunofluorescence pour Iba-1 antigène, ce qui indique l&#39;invasion et l&#39;entourant de GB MPIO marqué par la microglie BMSC-Luc/eGFP. </li></ol>

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	<li>Rodriguez-Porcel, M., Wu, J. C., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular imaging of stem cells. , (2008).</li><li>Bergwerf, I., De Vocht, N., Tambuyzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+gene-expressing+bone+marrow-derived+stromal+cells+are+immune-tolerated+following+implantation+in+the+central+nervous+system+of+syngeneic+immunocompetent+mice.">Reporter gene-expressing bone marrow-derived stromal cells are immune-tolerated following implantation in the central nervous system of syngeneic immunocompetent mice.</a> BMC Biotechnol. 9, 1 (2009).</li><li>Bergwerf, I., Tambuyzer, B., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+cellular+implants+by+the+brain's+innate+immune+system.">Recognition of cellular implants by the brain's innate immune system.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 511-516 (2011).</li><li>Bradbury, M. S., Panagiotakos, G., Chan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+bioluminescence+imaging+of+human+ES+cell+progeny+in+the+rodent+CNS.">Optical bioluminescence imaging of human ES cell progeny in the rodent CNS.</a> J. Neurochem. 102, 2029-2039 (2007).</li><li>De Vocht, N., Bergwerf, I., Vanhoutte, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+of+Luciferase/eGFP-Expressing+Bone+Marrow-Derived+Stromal+Cells+with+Fluorescent+Micron-Sized+Iron+Oxide+Particles+Improves+Quantitative+and+Qualitative+Multimodal+Imaging+of+Cellular+Grafts+In+Vivo.">Labeling of Luciferase/eGFP-Expressing Bone Marrow-Derived Stromal Cells with Fluorescent Micron-Sized Iron Oxide Particles Improves Quantitative and Qualitative Multimodal Imaging of Cellular Grafts In Vivo.</a> Mol Imaging Biol. , (2011).</li><li>Reekmans, K., Praet, J., Daans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Challenges+for+the+Advancement+of+Neural+Stem+Cell+Biology+and+Transplantation+Research.">Current Challenges for the Advancement of Neural Stem Cell Biology and Transplantation Research.</a> Stem Cell Rev. , (2011).</li><li>Reekmans, K. P., Praet, J., De Vocht, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+potential+of+intravenous+neural+stem+cell+delivery+for+treatment+of+neuroinflammatory+disease+in+mice.">Clinical potential of intravenous neural stem cell delivery for treatment of neuroinflammatory disease in mice.</a> Cell Transplant. 20, 851-869 (2011).</li><li>Contag, C. H., Bachmann, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+gene+expression.">Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002).</li><li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging.">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2, 511-540 (2005).</li><li>Sykova, E., Jendelova, P., Herynek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MR+tracking+of+stem+cells+in+living+recipients.">MR tracking of stem cells in living recipients.</a> Methods Mol. Biol. 549, 197-215 (2009).</li><li>Daadi, M. M., Li, Z., Arac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+magnetic+resonance+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+stem+cell+grafts+in+ischemic+rat.">Molecular and magnetic resonance imaging of human embryonic stem cell-derived neural stem cell grafts in ischemic rat.</a> 17, 1282-1291 (2009).</li><li>Heyn, C., Ronald, J. A., Ramadan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+MRI+of+cancer+cell+fate+at+the+single-cell+level+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+metastasis+to+the+brain.">In vivo MRI of cancer cell fate at the single-cell level in a mouse model of breast cancer metastasis to the brain.</a> Magn. Reson. Med. 56, 1001-1010 (2006).</li><li>Hoehn, M., Kustermann, E., Blunk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+implanted+stem+cell+migration+in+vivo:+a+highly+resolved+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+investigation+of+experimental+stroke+in+rat.">Monitoring of implanted stem cell migration in vivo: a highly resolved in vivo magnetic resonance imaging investigation of experimental stroke in rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16267-16272 (2002).</li><li>Jendelova, P., Herynek, V., DeCroos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+fate+of+implanted+bone+marrow+stromal+cells+labeled+with+superparamagnetic+nanoparticles.">Imaging the fate of implanted bone marrow stromal cells labeled with superparamagnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 50, 767-776 (2003).</li><li>Modo, M., Mellodew, K., Cash, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+transplanted+stem+cell+migration+after+a+stroke:+a+serial,+in+vivo+magnetic+resonance+imaging+study.">Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study.</a> Neuroimage. 21, 311-317 (2004).</li><li>Boutry, S., Brunin, S., Mahieu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+labeling+of+non-phagocytic+adherent+cells+with+iron+oxide+nanoparticles:+a+comprehensive+study.">Magnetic labeling of non-phagocytic adherent cells with iron oxide nanoparticles: a comprehensive study.</a> Contrast Media Mol. Imaging. 3, 223-232 (2008).</li><li>Mailander, V., Lorenz, M. R., Holzapfel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylated+superparamagnetic+iron+oxide+particles+label+cells+intracellularly+without+transfection+agents.">Carboxylated superparamagnetic iron oxide particles label cells intracellularly without transfection agents.</a> Mol Imaging Biol. 10, 138-146 (2008).</li><li>Modo, M., Hoehn, M., Bulte, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+MR+imaging.">Cellular MR imaging.</a> Mol. Imaging. 4, 143-164 (2005).</li><li>Hinds, K. A., Hill, J. M., Shapiro, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+endosomal+labeling+of+progenitor+and+stem+cells+with+large+magnetic+particles+allows+magnetic+resonance+imaging+of+single+cells.">Highly efficient endosomal labeling of progenitor and stem cells with large magnetic particles allows magnetic resonance imaging of single cells.</a> Blood. 102, 867-872 (2003).</li><li>Shapiro, E. M., Sharer, K., Skrtic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+detection+of+single+cells+by+MRI.">In vivo detection of single cells by MRI.</a> Magn. Reson. Med. 55, 242-249 (2006).</li><li>Shapiro, E. M., Skrtic, S., Sharer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+single+particles+for+cellular+imaging.">MRI detection of single particles for cellular imaging.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10901-10906 (2004).</li><li>Crabbe, A., Vandeputte, C., Dresselaers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+MRI+contrast+agents+on+the+stem+cell+phenotype.">Effects of MRI contrast agents on the stem cell phenotype.</a> Cell Transplant. 19, 919-936 (2010).</li><li>Szarecka, A., Xu, Y., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+firefly+luciferase+inhibition+by+general+anesthetics:+Gaussian+and+anisotropic+network+analyses.">Dynamics of firefly luciferase inhibition by general anesthetics: Gaussian and anisotropic network analyses.</a> Biophys. J. 93, 1895-1905 (2007).</li><li>Keyaerts, M., Heneweer, C., Gainkam, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+protein+binding+of+luciferase+substrates+influences+sensitivity+and+accuracy+of+bioluminescence+imaging.">Plasma protein binding of luciferase substrates influences sensitivity and accuracy of bioluminescence imaging.</a> Mol. Imaging. Biol. 13, 59-66 (2011).</li><li>Keyaerts, M., Verschueren, J., Bos, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+bioluminescence+imaging+for+quantitative+tumour+burden+assessment+using+IV+or+IP+administration+of+D:+-luciferin:+effect+on+intensity,+time+kinetics+and+repeatability+of+photon+emission.">Dynamic bioluminescence imaging for quantitative tumour burden assessment using IV or IP administration of D: -luciferin: effect on intensity, time kinetics and repeatability of photon emission.</a> Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 999-1007 (2008).</li><li>Zhang, Y., Bressler, J. P., Neal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2/BCRP+expression+modulates+D-Luciferin+based+bioluminescence+imaging.">ABCG2/BCRP expression modulates D-Luciferin based bioluminescence imaging.</a> Cancer Res. 67, 9389-9397 (2007).</li><li>Brightwell, G., Poirier, V., Cole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum-dependent+and+cell+cycle-dependent+expression+from+a+cytomegalovirus-based+mammalian+expression+vector.">Serum-dependent and cell cycle-dependent expression from a cytomegalovirus-based mammalian expression vector.</a> Gene. 194, 115-123 (1997).</li><li>Grassi, G., Maccaroni, P., Meyer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+DNA+methylation+and+histone+deacetylation+activate+cytomegalovirus+promoter-controlled+reporter+gene+expression+in+human+glioblastoma+cell+line+U87.">Inhibitors of DNA methylation and histone deacetylation activate cytomegalovirus promoter-controlled reporter gene expression in human glioblastoma cell line U87.</a> Carcinogenesis. 24, 1625-1635 (2003).</li><li>Krishnan, M., Park, J. M., Cao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+epigenetic+modulation+on+reporter+gene+expression:+implications+for+stem+cell+imaging.">Effects of epigenetic modulation on reporter gene expression: implications for stem cell imaging.</a> FASEB J. 20, 106-108 (2006).</li><li>Svensson, R. U., Barnes, J. M., Rokhlin, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+agents+up-regulate+the+cytomegalovirus+promoter:+implications+for+bioluminescence+imaging+of+tumor+response+to+therapy.">Chemotherapeutic agents up-regulate the cytomegalovirus promoter: implications for bioluminescence imaging of tumor response to therapy.</a> Cancer Res. 67, 10445-10454 (2007).</li></ol>

Les auteurs déclarent aucun conflit d&#39;intérêts.

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole optimisé pour la combinaison de trois modalités d&#39;imagerie complémentaires (BLI, l&#39;IRM et l&#39;histologie) pour la caractérisation détaillée des implants cellulaires dans le SNC de la souris immunitaires compétentes. Une combinaison de l&#39;étiquetage gène rapporteur de cellules, basée sur la modification génétique avec des gènes rapporteurs luciférase de luciole et eGFP, et un étiquetage directe de la cellule avec Go MPIO, conduit à une évaluation...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722f </td><td> Composante de la CEM moyen de croissance des cellules </td></tr><tr><td> Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> Composante de la CEM moyen de croissance des cellules </td></tr><tr><td> Sérum de cheval </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> Composante de la CEM moyen de croissance des cellules </td></tr><tr><td> La pénicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> Composante de la CEM moyen de croissance des cellules </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> Composante de la CEM moyen de croissance des cellules </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycine </td><td> Invivogen </td><td> ant-pr-1 </td><td></td></tr><tr><td> trypsine </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> Bangs Laboratories </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciférine </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> La kétamine (Kétalar) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazine (Rompun) </td><td> Bayer Health Care </td><td></td><td></td></tr><tr><td> L&#39;isoflurane </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de NaCl </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> paraformaldéhyde </td><td> Merck </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> saccharose </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-pompe à injection </td><td> KD scientifique </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> Photon imageur </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9.4T MR scanner </td><td> Bruker Biospin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 microscope </td><td> Olympe </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom HM cryostat </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> seringue </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille de calibre 30 </td><td> Hamilton </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Photo Vision logiciels </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision logiciels </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5.1 Logiciels </td><td> Bruker Biospin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amira 4.0 du logiciel </td><td> Imagerie Visage </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal imaging of stem cell implantation in the central nervous system of mice

Au cours de la dernière décennie, la transplantation de cellules souches a suscité un intérêt croissant en tant que modalité thérapeutique primaire ou secondaire pour une variété de maladies, à la fois dans les études précliniques et cliniques. Toutefois, à ce jour les résultats concernant les résultats fonctionnels et / ou la régénération des tissus après la transplantation de cellules souches sont très variés. En règle générale, un bénéfice clinique est observé sans une profonde compréhension du mécanisme sous-jacent (s) 1. Par conséquent, des efforts multiples ont conduit à l&#39;élaboration des différentes modalités d&#39;imagerie moléculaire pour contrôler la greffe de cellules souches dans le but ultime d&#39;évaluer avec précision la survie, le destin et la physiologie des cellules souches greffées et / ou de leur micro-environnement. Les changements observés dans un ou plusieurs paramètres déterminés par l&#39;imagerie moléculaire pourrait être liée à l&#39;effet observé clinique. Dans ce contexte, nos études portent sur l&#39;utilisation combinée de l&#39;imagerie par bioluminescence (BLI), imagerie par résonance magnétique (IRM) et histologiques analysis pour évaluer les cellules souches de greffage. BLI est couramment utilisé pour effectuer de façon non invasive suivi de cellules et de surveiller la survie des cellules dans le temps après une transplantation 2-7, basé sur une réaction biochimique dans laquelle les cellules exprimant le gène de la luciférase-rapporteur sont capables d&#39;émettre de la lumière d&#39;interaction suivant avec son substrat (par exemple D- luciférine) 8, 9. IRM d&#39;autre part est une technique non invasive qui est cliniquement applicable 10 et peut être utilisé pour localiser précisément des greffes cellulaires à très haute résolution 11-15, même si sa sensibilité dépend fortement le contraste généré après marquage des cellules avec un agent de contraste IRM . Enfin, post-mortem analyse histologique est la méthode de choix pour valider les résultats de recherche obtenus avec des techniques non invasives avec la plus haute résolution et la sensibilité. Par ailleurs point final analyse histologique nous permet d&#39;effectuer une analyse détaillée des phénotypique des cellules greffées et / ou les tissus environnants, based sur l&#39;utilisation des protéines rapporteurs fluorescents et / ou d&#39;étiquetage directe de la cellule avec des anticorps spécifiques. En résumé, nous avons ici démontrer visuellement les complémentarités de BLI, l&#39;IRM et l&#39;histologie de démêler les cellules souches et différente / ou de l&#39;environnement associée à des caractéristiques suivantes sur les cellules souches de greffage dans le SNC de la souris. A titre d&#39;exemple, la moelle osseuse de cellules dérivées du stroma, génétiquement modifiées pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et la luciférase de luciole (fluctuations), et étiquetés avec le bleu fluo de taille micronique des particules d&#39;oxyde de fer (MPIOs), seront greffés dans le SNC de souris immuno-compétentes et les résultats seront suivis par BLI, l&#39;IRM et l&#39;histologie (figure 1).

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Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Cet article décrit une séquence d&#39;événements optimisé pour l&#39;imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l&#39;imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d&#39;imagerie sur un seul animal permet cellulaire d&#39;évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Imagerie multimodale d&#39;implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K vues.  University of Antwerp. Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

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Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Section du nerf optique: un modèle de l&#39;apoptose neuronale des adultes dans le système nerveux central

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Recherche

Neurosciences

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La production de vecteurs lentiviraux pour les cellules de transduction du Système Nerveux Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Étiquetage des cellules isolées dans le système nerveux central des<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Livraison intraventriculaire directe des médicaments pour le système nerveux central rongeurs

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogation in vivo de système nerveux central Translatome par polyribosome fractionnement

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Evaluation fonctionnelle des neurotoxines biologique dans les cultures en réseau de cellules souches dérivées neurones système central nerveux

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

De l&#39;imagerie in situ de Ca du système nerveux entérique

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing optique du système nerveux central de souris utilisant CLARITY passive

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Enregistrement électrophysiologique de l’activité du système nerveux Central du troisième stade de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...