Les mitochondries dépendent fortement du génome nucléaire, bien qu’elles aient leur propre ADN. Ainsi, un mécanisme d’importation hautement réglementé est nécessaire. Cette méthode aide à étudier le processus et comment il peut s’adapter aux stimuli externes.
C’est la seule technique biochimique disponible pour évaluer quantitativement l’importation de protéines dans les différents sous-compartiments des mitochondries. La viabilité des mitochondries est impliquée dans divers états pathologiques, de sorte que la compréhension de la façon dont l’importation de protéines est régulée peut aider à contribuer à de nouvelles approches thérapeutiques qui ciblent les mitochondries. Des soins supplémentaires sont nécessaires pendant l’isolement pour assurer la viabilité et l’intégrité des mitochondries.
Un hachage minutieux du tissu et une remise en suspension douce de toutes les pastilles suivantes sont nécessaires. Ashley Oliveira, doctorante dans mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer l’isolement des mitochondries du muscle squelettique, retirez la graisse et le tissu conjonctif des muscles et hachez les tissus sur un verre de montre pré-refroidi jusqu’à ce qu’il s’agisse d’une boue homogène.
Placez le tissu haché dans un tube de centrifugation en plastique pré-refroidi de 50 millilitres et enregistrez le poids exact. Ensuite, diluez le tissu haché dix fois avec le tampon 1 contenant de l’ATP. Utilisez un homogénéisateur à double lame de huit millimètres pour homogénéiser l’échantillon musculaire à une puissance de sortie de 9,8 Hertz pendant 10 secondes, en veillant à ce qu’il ne reste aucun morceau de muscle visible.
Après avoir fait tourner l’échantillon à 9 000 x G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius, remettez soigneusement la pastille dans environ 95 microlitres du milieu de remise en suspension. Centrifuger l’échantillon avant de jeter le surnageant et remettre en suspension doucement la pastille avec environ 180 microlitres de milieu de remise en suspension à l’aide d’une pipette P-200. Pour la traduction in vitro, préparez suffisamment de mélange de réactions de traduction pour fournir 20 microlitres par échantillon de mitochondries à utiliser dans l’expérience d’importation et pour une voie de traduction.
Placez la réaction pour l’incubation à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. 15 minutes après le début de la réaction de traduction, aliquote 90 microgrammes de mitochondries dans des tubes stériles de 1,5 millilitre et pré-incuber à 30 degrés Celsius pendant 10 minutes. Dans un nouvel ensemble de tubes stériles de 1,5 millilitre, combinez 75 microgrammes de mitochondries avec 18 microlitres de la réaction de traduction et incubez le tube à 30 degrés Celsius pendant le temps souhaité.
Conservez le volume restant de la réaction de translation sur la glace. Pour mettre fin à la réaction d’importation après le temps d’incubation approprié, retirez le tube de 30 degrés Celsius pour le placer sur la glace, puis transférez soigneusement la réaction d’importation sur le dessus du tube avec le coussin de saccharose. Centrifuger les échantillons avec un coussin de saccharose à 17 000x G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
À l’aide d’une pipette P-1000, retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Pour importer dans la membrane externe, effectuez la réaction à l’aide de Tom40 et remettez en suspension la pastille dans 50 microlitres de carbonate de sodium 0,1 molaire fraîchement préparé et incubez sur de la glace pendant 30 minutes. Après l’incubation, centrifuger l’échantillon à 14 000 x G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.
Ensuite, préparez les échantillons pour l’électrophorèse SDS-PAGE comme décrit dans le manuscrit. Préparer la voie de translation de contrôle en mélangeant trois microlitres de la réaction de translation restante avec 37 microlitres de tampon de lyse et cinq microlitres de colorant d’échantillon. Faites bouillir les échantillons pendant cinq minutes à 95 degrés Celsius et tournez doucement à basse vitesse pour éviter de granuler les mitochondries.
Après avoir appliqué des échantillons sur du gel de polyacrylamide SDS, faire bouillir le gel dans de l’acide trichloroacétique à 5%, ou TCA, dans une hotte pendant cinq minutes sous agitation continue. Ensuite, placez le gel dans de l’eau double distillée sur une plaque rotative pendant une minute à 50 rotations par minute. Lavez le gel dans du Tris de 10 millimolaires sur une plaque rotative pendant cinq minutes à 50 rotations par minute.
Pour précipiter la protéine, lavez le gel dans un volume suffisant d’acide salicytique à une molaire pour couvrir le gel sur une plaque tournante pendant 30 minutes. Pour déshydrater le gel, placez une grande feuille de papier buvard sur le lit poreux du séchoir à gel et une feuille d’essuie-tout dans la zone où le gel sera appliqué. Ensuite, coupez un morceau de papier buvard de 11 centimètres sur 9 centimètres et placez le papier sur l’essuie-tout.
Utilisez un deuxième morceau de papier buvard de 11 centimètres sur 9 centimètres pour extraire le gel du récipient et déposer le gel à plat sur le dessus du premier morceau. Placez un morceau de plastique légèrement plus grand sur le gel, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de plis ou de bulles sous l’enveloppe. Ensuite, déposez le couvercle en plastique du séchoir à gel sur le dessus de l’emballage.
Allumez l’aspirateur. Assurez-vous que le couvercle en plastique a formé un joint en soulevant le coin du couvercle en plastique et en attendant que le couvercle soit refermé. Fermez le séchoir à gel pour qu’il fonctionne pendant 90 minutes, en commençant à 30 degrés Celsius pour atteindre 80 degrés Celsius progressivement, et revenez à 30 degrés Celsius à la fin de la course.
Enveloppez le gel dans la pellicule de plastique utilisée dans le processus de séchage. Une fois déshydraté, le gel se solidifiera et se sentira mince en papier. Placez le gel déshydraté dans une cassette avec un film phosphoreux sur le dessus.
Exposez le film pendant 24 heures avant de visualiser le gel à l’aide de l’autoradiographie avec tout imageur approprié capable d’imagerie au phosphore. L’analyse représentative montre les taux normaux d’importation de la malate déshydrogénase, ou MDH, dans les mitochondries sous-sarcommateuses et intermyofibrillaires, et le produit de traduction du précurseur MDH. L’ajout de valinomycine a inhibé l’importation de protéines MDH dans la matrice des mitochondries SS et IMF.
De même, le détergent Triton X a inhibé l’importation de MDH dans les deux sous-fractions en raison de la solubilisation de la membrane interne. L’estimation de l’importation de protéines a été effectuée pour des durées croissantes, et les données qui en ont résulté ont montré que l’importation est un processus dépendant du temps, et que les mitochondries SS et IMF ont des taux ou des capacités d’importation différents. Lorsque les rats ont été soumis à une stimulation électrique, l’importation de Tom 40 dans la membrane externe était plus élevée dans le muscle des animaux stimulés de manière chronique par rapport aux témoins.
L’importation d’ornithine transcarbamylase, ou OCT, dans la matrice mitochondriale a été augmentée à chaque point d’incubation, ce qui a entraîné une augmentation de 1,4 fois des mitochondries du muscle stimulé de manière chronique. L’importation de protéines a été positivement corrélée avec un indice de contenu mitochondrial et évaluée par l’activité de la COX. En étudiant l’apoptose à médiation mitochondriale, les animaux Bax et Bak à double knockout ont présenté une importation réduite de protéines dans la matrice mitochondriale.
Six semaines de course volontaire sur roue ont sauvé le défaut d’importation chez les animaux à double élimination. Il est important de prendre en compte des variables telles que la durée de la réaction d’importation et la protéine à importer. Des fractions cytosoliques peuvent être incorporées dans la réaction pour comprendre comment les facteurs cytosoliques peuvent influencer le taux d’importation.
Alternativement, les protéines peuvent être modifiées avant l’incubation pour comprendre comment les protéines peuvent être importées sélectivement. Cette technique peut aider à comprendre les étiologies complexes des myopathies mitochondriales qui peuvent se présenter dans divers états pathologiques.
