Ce protocole est significatif parce qu’il fournit une approche générale à l’ingénierie des systèmes de diménisation des protéines comme biocapteurs pour une variété de petites molécules. En outre, il utilise une bibliothèque de protéines très diversifiée pour sélectionner des biocapteurs pour différents ligands d’une manière efficace et rentable sans avoir besoin d’équipement spécialisé. Le biocapteur conçu peut être utilisé pour contrôler chimiquement le comportement cellulaire et pour surveiller les changements en temps réel dans les métabolites cellulaires.
Grâce à cette démonstration visuelle, les chercheurs peuvent observer une instruction détaillée des techniques avec une attente claire de la production expérimentale. Commencez chaque ronde de sélection en cultivant une seule colonie cellulaire compétente en électroporation TG1 en six millilitres de milieu 2YT à 37 degrés Celsius et 250 révolutions par minute à une absorption de 600 nanomètres d’environ 0,5. Lorsque la densité optique optimale a été atteinte, placez les cellules sur la glace.
Pour préparer les perles de sélection négatives, lavez 300 microlitres de perles magnétiques enduites de streptavidine trois fois avec un millilitre de 05%PBS plus tampon Tween et deux fois avec un millilitre de PBS par lavage sur une grille de séparation magnétique. Resuspendez les perles avec un millilitre de 1% de caséine dans PBS, et saturez les perles avec de la biotine à cinq fois la capacité de liaison déclarée des perles. Après une heure à température ambiante avec rotation, laver les perles cinq fois avec PBS plus Tween et trois fois avec PBS comme démontré.
Après le dernier lavage, ajouter environ une fois 10 aux 13 particules de phage dans 1% de caséine et 1% d’albumine de sérum bovin dans PBS aux perles pour une incubation d’une heure à température ambiante avec rotation. À la fin de l’incubation, transférer le supernatant dans un tube de 1,5 millilitre. Pour une sélection positive avec les perles de streptavidine biotinylées liées à la ligand, saturer la moitié du volume de perles utilisées pour la sélection négative dans le ligand biotinylated de choix à cinq fois la pleine capacité de liaison tel que calculé selon le manuel.
Après une incubation d’une heure à température ambiante avec rotation, laver les perles cinq fois avec PBS plus Tween et trois fois avec PBS seul comme démontré, et bloquer les perles avec un millilitre de 1% de caséine et 1% albumine sérique bovine pendant une heure avec rotation. À la fin de l’incubation, lavez les perles magnétiques enduites de streptavidine trois fois dans PBS plus Tween et une fois dans PBS seul comme démontré, et utilisez le phage non lié pour résuspendre les perles magnétiques streptavidin-enduites. Extraire le supernatant non lié contenant du phage sans déranger les perles, et mettre l’échantillon de côté pour être utilisé comme entrée.
Ensuite, lavez les perles 10 fois avec PBS plus Tween et cinq fois avec PBS comme démontré, le transfert des perles à un nouveau tube après tous les trois lavages pour éviter la liaison non spécifique des phages liés aux parois du tube. Pour élucider de façon compétitive les phages liés, ajouter 450 microlitres d’une concentration micromolaire de ligand non biotinylé aux perles de sélection positives, et placer les perles en rotation pendant 30 minutes. À la fin de l’incubation, transférer le surnatant dans un nouveau tube pour l’utiliser comme sortie.
Pour la titration des entrées, préparez 10 dilutions en série dans PBS jusqu’à une fois 10 à la 9 fois avec le phage d’entrée. Transférer 10 microlitres de phage d’entrée de la fois 10 à la sept à 10 aux neuf dilutions à 70-microliter aliquots des cellules TG1 préparées. Après 45 minutes à 37 degrés Celsius, plaquez les cellules TG1 infectées sur des plats individuels d’agar 2YT de 90 millimètres contenant 100 microgrammes par millilitre d’ampicilline et 2 % de glucose pour une incubation nocturne à 37 degrés Celsius.
Le lendemain matin, utilisez la formule pour calculer l’entrée du phage. Pour l’infection de sortie et la titration, ajoutez les phages éduqués à trois millilitres de cellules TG1 pour une incubation de 45 minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Préparez ensuite 10 dilutions périodiques des cellules infectées dans un milieu frais de 2YT jusqu’à une fois 10 à la troisième concentration, et assiettez chaque dilution sur des plats d’agar 2YT de 90 millimètres pour leur incubation nocturne à 37 degrés Celsius.
Le lendemain matin, calculer la sortie du phage selon la formule. Pour isoler les clones individuels d’un sous-libéral enrichi, transférez des colonies individuelles des plaques cellulaires TG1 cultivées pendant la nuit et infectées par le phage en 250 microlitres de milieu 2YT complétés par de l’ampicilline par puits dans des plaques stériles de puits profonds pour leur culture nocturne à 37 degrés Celsius. Lorsque les cellules atteignent une densité de 600 nanomètres d’environ 0,5, ajouter cinq fois 10 aux neuf unités de formation de plaques par millilitre de phage d’aide CM13 à chaque puits, et incuber les cellules pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius à 250 rotations par minute.
À la fin de l’incubation, ajouter 500 microlitres de milieu 2YT complétés par de l’ampicilline et 50 microgrammes par millilitre de kanamycine à chaque puits, et placer la plaque à 25 degrés Celsius et 250 rotations par minute pendant la nuit. Le lendemain matin, sédimenter les cellules par centrifugation pour permettre la collecte des particules de phage. Pour valider la fixation de l’ancre par ELISA, enduire les plaques ELISA de 96 puits de 100 microlitres de cinq microgrammes par streptavidine millilitre dans le tampon de revêtement à quatre degrés Celsius pendant la nuit.
Le lendemain matin, lavez les plaques trois fois dans 300 microlitres de PBS plus Tween avant d’ajouter 100 microlitres de cible biotinylée d’un micromolaire aux puits cibles et 100 microlitres de biotine d’un micromolaire ou d’homolog cible aux puits de contrôle appropriés. Après une heure à température ambiante, laver les assiettes cinq fois avec du PBS plus du tween par lavage, et bloquer toute liaison non spécifique avec 300 microlitres de 1% de caséine par puits pendant une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, laver les assiettes trois fois en PBS frais plus tween par lavage, et ajouter le supernatant purifié phage.
Après une heure à température ambiante, laver les assiettes 10 fois avec du PBS frais plus du tween par lavage. Ajouter 100 microlitres d’anticorps protéiques m13 à chaque puits pour une incubation d’une heure à température ambiante. Lavez ensuite les plaques trois fois comme démontré, et ajoutez 100 microlitres de substrat TMB à chaque puits pour une incubation de 10 minutes à température ambiante ou jusqu’à ce qu’un changement de couleur visible soit observé.
Ensuite, arrêtez la réaction avec 100 microlitres d’acide chlorhydrique un molaire par puits, et lisez la plaque à 450 nanomètres sur un spectrophotomètre. Après validation du liant d’ancrage, le criblage du liant de diméisation devrait également être effectué à l’aide de la même bibliothèque de protéines ciblant le complexe liant-ligand d’ancrage. Les résultats typiques de l’enrichissement après quatre à six rondes de sélection sont une bonne indication qu’il y a un rapport élevé de coups potentiels dans les sous-livres, auquel cas d’autres rondes de sélection peuvent ne pas être nécessaires.
Elisa mono-clone est adapté pour analyser l’affinité relative contraignante et la sélectivité des liants d’ancrage et de diménisation et facilite la comparaison de la sélectivité contraignante entre les clones. De même, la sélection des liants de dimérisation permet l’identification de clones qui forment un heterodimer avec le liant d’ancrage immobilisé uniquement avec ou sans ligand. Ces données contraignantes dépendantes de la concentration ligand suggèrent que les nanocorps testés conviennent à la construction d’un système de dimémissement induit chimiquement par rapport à la mauvaise liaison démontrée par les échantillons de contrôle.
En outre, la chromatographie analytique d’exclusion de taille peut être employée pour confirmer la formation d’heterodimer entre les liants d’ancrage et de dimérisation en présence du ligand. Par exemple, dans cette expérience, un pic de diménisation a été observé lorsque les liants d’ancrage et de diménisation et le cannabidiol étaient mélangés. En revanche, aucun pic de diménisation n’a été détecté en l’absence de cannabidiol ou lorsque chaque liant a été chargé à la colonne seul.
Le système de diménisation des protéines doit être génétiquement codé dans des cellules de levure ou de mammifères afin de permettre une vérification plus approfondie des biocapteurs sélectionnés pour le développement d’applications in vivo. Nous nous attendons à ce que cette méthode donne à d’autres chercheurs les outils efficaces et nécessaires pour détecter les métabolites importants, les molécules de signalisation, ou les médicaments in vivo avec une résolution spatiotemporal élevée.
