Dans cette vidéo, nous décrivons une étude modèle pour le mécanisme de toxicité amyloïde au niveau de la membrane utilisant les mitochondries de cerveau de rat comme modèle biologique in vitro. En dépit de l’accumulation de rapport décrivant le mécanisme des perturbations de membrane par l’agrégat amyloïde dans les systèmes modèles phospholipides étudiés ciblant directement les événements commençant à développer la membrane biologique. Dans la présente vidéo, nous décrivons les fibrilles amyloïdes de l’alpha-synucléine analysant la membrane des mitochondries cérébrales du rat comme modèle biologique in vitro.
Nous croyons que les mitochondries en tant qu’organite avec les membranes bien caractérisées peuvent fournir un système biologique extrêmement utile de modèle pour des études moléculaires liées au mécanisme de cytotoxicité amyloïde au niveau de membrane relatif aux maladies neurodegenerative. Décapiter le rat avec une petite guillotine animale et retirer le cerveau de l’écaille dans la minute qui a pris la décapitation du rat pour limiter la détérioration possible des propriétés mitochondriales. Il est important de travailler rapidement et de tout garder sur la glace tout au long de la procédure.
Lavez le tissu deux fois avec 30 millilitres de tampon d’isolement. Transférer dans un bécher contenant un tampon d’isolement froid et hacher finement le cerveau avec des ciseaux. Transférer la suspension tissulaire dans un homogénéiseur dounce froid de 20 millilitres.
Homogénéiser les morceaux de tissu à l’aide de neuf coups de haut en bas avec un pilon motorisé. Laissez le mélange sur la glace pendant environ 30 secondes après chaque série de trois coups d’homogénéisation pour s’assurer que l’homogénéité reste froide. Transférer l’homogénéate dans un tube de centrifugeuse pré-refroidi et une centrifugeuse à 1300 G à quatre Centigrades pendant trois minutes.
Décanter soigneusement le supernatant et le transférer dans un tube de centrifugeuse pré-refroidi. Centrifugeuse à 21 000 G à 4 Centigrades pendant 10 minutes. Jetez le supernatant et resuspendez la pastille dans un milieu de gradient de densité en remuant doucement le mélange avec la pipette.
Centrifugeuse dans un rotor à angle fixe à 30 700 G à quatre Centigrades pendant cinq minutes. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirer l’extrémité tranchante du matériau accumulé au sommet, qui contient principalement de la myéline. Ajouter un tampon d’isolement de huit millilitres à la fraction mitochondriale tout en remuant doucement le mélange avec la pipette.
Centrifugeuse à 16 700 G à 4 Centigrades pendant 10 minutes. Retirez soigneusement le supernatant, en laissant la pastille lâche du fond intacte. Ajouter un millilitre de 10 milligrammes par millilitre de BSA sans acide gras au tube de centrifugeuse tout en remuant doucement le mélange avec la pointe de la pipette.
Composent le volume à cinq millilitres en ajoutant un tampon d’isolement. Centrifugeuse à 6 900 G à 4 Centigrades pendant 10 minutes. Cela devrait produire une pastille ferme.
Décanter le supernatant et resuspendre doucement la pastille mitochondriale dans un tampon d’isolement. Diluer l’homogénéité mitochondriale à un milligramme par millilitre avec tampon d’isolement froid et placer dans deux tubes de 1,5 millilitre, généralement 195 microlitres de mitochondries par tube. Ajouter cinq microlitres 20% de volume par volume Triton X-100 à un tube comme contrôle positif pour l’activité enzymatique maximale et cinq microlitres d’eau déionisée à un autre tube pour le contrôle, suivie par le mélange avec un agitateur.
Incuber les tubes pendant 10 minutes dans un bain d’eau chaude réglé à 30 Centigrades. Mitochondries de granulés par centrifugation des tubes dans un rotor à angle fixe à 16 000 G quatre Centigrades pendant 15 minutes. Recueillir soigneusement les supernatants résultants pour évaluer l’activité de la déshydrogénase malate mitochondriale à l’aide d’un test spectrophotométrique standard décrit sur la partie suivante.
Calculez l’intégrité de la membrane mitochondriale comme suit. Pour la détermination de l’activité de déshydrogénase malate, pipette 890 et 880 microlitres 50 millimollar Tris-HCL tampon à blanc et échantillonner les cuvettes d’essai respectivement suivie de 100 microlitres 50 millimollar oxaloacetate et 10 microlitres de 10 millimollar bêta-NADH. Mettez les cuvettes dans un spectrophotomètre et faites référence contre le blanc.
Ajouter 10 microlitres d’homogénéité mitochondriale d’un milligramme par millilitre pour échantillonner la cuvette. Mélanger immédiatement par inversion. Diminution record de l’absorption due à l’oxydation du NADH à 340 nanomètres pendant une minute.
Pour la fibrillation amyloïde alpha-synucléine, ajouter 294 microlitres de solution protéique, 200 micromolaires à chaque tube de 1,5 millilitre. Ajoutez ensuite six microlitres solution ThT d’un millimolaire. Mélanger les solutions et incuber les tubes dans un thermomixeur à 37 Centigrades en remuant constamment à 800 RPM.
Pour la fibrillation amyloïde à insuline bovine, ajouter 637 microlitres de solution protéique, 250 micromolaires à 1,5 millilitre de tube. Ajouter ensuite la solution ThT de 13 microlitres d’un millimolaire suivie de remuer. Ajouter aliquots 200 microlitres de solutions protéiques à chaque puits d’une plaque de fond clair de 96 puits.
Sceller la plaque avec du ruban d’étanchéité limpide. Chargez la plaque dans cytation 5 lecteur de plaque de fluorescence. Mesurer la fluorescence tht à intervalles de 30 minutes pendant 12 heures.
Utilisez excitation à 440 nanomètres et émission à 485 nanomètres. Sélectionnez les puits. Secouez la plaque pendant cinq secondes avant chaque mesure.
Réglez la température à 57 Centigrades sans agitation. Préparez deux séries de tubes de 1,5 millilitre contenant des homogénéités mitochondriales, une série pour l’analyse de libération MDH et d’autres pour la mesure mitochondriale ROS. Ajouter des aliquots de fibrilles fraîches ou amyloïdes d’alpha-synucléine, d’insuline bovine ou de lysozyme de blanc d’œuf de poule à l’homogénéité mitochondriale suivie d’un pipetage en douceur.
Tubes d’incubation contenant des suspensions mitochondriales pendant 30 minutes dans un bain d’eau chaude réglé à 30 Centigrades. Pour déshydrogénase malate, la centrifugeuse a incubé des homogénéités mitochondriales à 16 000 G pendant 15 minutes. Recueillir soigneusement les supernatants résultants pour évaluer l’activité de MDH mitochondrial tel que décrit sur la partie quatre de section de protocole.
Calculez la libération de MDH comme suit. Pour la mesure mitochondriale de ROS, pipette 191 microliter d’homogénéité mitochondriale incubée à chaque puits d’une plaque de 96 puits. Ajouter quatre microlitres de 50 micromolaires DCFDA.
Ajouter ensuite cinq microlitres de succinate de 200 millimlaires. Incuber la plaque pendant 30 minutes dans un bain d’eau chaude réglé à 30 Centigrades tout en remuant doucement. Chargez la plaque dans un lecteur de plaque de fluorescence Cytation 5 et mesurez l’intensité de fluorescence selon la section protocole.
L’intégrité mitochondrique de membrane a été évaluée en mesurant l’activité de MDH dans les mitochondries isolées avant et après la perturbation de membrane et la libération enzymatique par Triton X-100. Comme vous le voyez, nous avons généralement constaté que les préparations mitochondriales sont d’environ 93% intactes. L’essai de fluorescence de ThT a été effectué pour surveiller la croissance des fibrilles amyloïdes.
La courbe pour la fibrillation amyloïde de trois protéines a montré un modèle sigmoidal typique, atteignant à un plateau à environ 96, 12, et 96 heures pour l’alpha-synucléine, l’insuline bovine, et le lysozyme blanc d’oeuf de poule respectivement, suggérant la formation des fibrilles amyloïdes qui a été plus confirmée par la mesure d’AFM. La perméabilisation possible et les dommages de la membrane mitochondrique par les fibrilles amyloïdes ont été étudiés par la libération du MDH mitochondrial et de la mesure mitochondrique de ROS. Comme vous le voyez dans le graphique gauche, la libération substantielle de MDH a été observée sur l’addition des fibrilles amyloïdes d’alpha-synuclein aux mitochondries.
Tandis qu’une légère libération a été détectée par des fibrilles d’insuline, les fibrilles de lysozyme blanc d’oeuf de poule se sont avérées inefficaces. Le graphique droit montre l’effet des fibrilles amyloïdes sur la teneur en ROS mitochondrial. Tandis qu’aucune amélioration significative dans ros mitochondrial n’a été observée sur l’addition du lysozyme blanc d’oeuf de poule ou des fibrilles amyloïdes d’insuline, le traitement avec des fibrils d’alpha-synuclein a mené à une augmentation considérable de la teneur en ROS des mitochondries de cerveau.
La présente vidéo décrit une étude modèle pour le mécanisme de cytotoxicité globale du péroné au niveau de la membrane, démontrant comment les fibrilles amyloïdes provenant de diverses protéines peuvent causer différents degrés de dommages à la membrane et de perméabilisation. Alors que certains sujets des fibrilles amyloïdes et de leur membrane de liaison spécifique semblent fournir la capacité d’interagir avec et de provoquer la déstabilisation et les perturbations subséquentes des membranes. Après cette vidéo, vous serez en mesure d’étudier l’interaction de la forme indigène, pré-fibrillar, et matures fibrilles amyloïdes de peptides différents et avec des mitochondries isolées de différents tissus ou diverses zones du cerveau.
