L’application de l’hybridation in situ par fluorescence appelée FISH à la stratification du risque génétique dans le myélome multiple est essentielle. La partie critique des rapports FISH n’est pas toutes les cellules nucléées, mais les plasmocytes clonaux spécifiquement purifiés ou identifiés par tri avec des billes magnétiques anti-CD138 ou marquage avec une immunoglobuline à chaîne légère cytoplasmique kappa ou Lambda avec un test FISH appelé cIg FISH. Interphase FISH après tri plasmocytaire ou cIg FISH s’avère significatif dans le diagnostic du myélome multiple, en raison de la proportion relativement plus faible de plasmocytes dans la moelle osseuse.
Cependant, ces méthodes présentent certaines lacunes, notamment des processus complexes, des exigences élevées en matière d’échantillons et des coûts expérimentaux élevés. Les plasmocytes peuvent être rapidement localisés dans un frottis de moelle osseuse. Sur cette base, nous utilisons le frottis de moelle osseuse FISH pour la détection des cellules du myélome multiple.
Cette étude a été menée selon les principes de la Déclaration d’Helsinki et approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan. Les échantillons ont été prélevés sur un patient atteint de myélome multiple au département d’hématologie de l’hôpital Zhongnan de l’Université de Wuhan en Chine. Placez le premier 0,2 millilitre de solution de moelle osseuse sur une lame de verre jetable propre, étalez les frottis de moelle osseuse à une épaisseur uniforme et à des queues pointues en retirant rapidement la moelle osseuse puis séchez-la naturellement.
Couvrir les pellicules de moelle osseuse d’un millilitre de solution de Wright-Giemsa pendant environ 10 secondes à température ambiante. Ajouter un millilitre de tampon phosphate aux lames, des précautions ont été nécessaires pour empêcher la solution de colorant de sécher ou de s’écouler des lames. Mélangez doucement la solution de colorant et maintenez-la pendant 15 minutes à température ambiante.
Rincez les lames à l’eau claire et séchez-les à l’air à température ambiante. Utilisez la microscopie optique avancée pour détecter les plasmocytes malins, les plasmocytes doivent être bien dispersés. Maintenant, ce que nous voyons sur le terrain, ce sont les plasmocytes qui sont assez dispersés.
Il s’agit d’une cellule de plasma nucléaire Binucléaire typique. Couvrir la zone hybridée avec une solution fixative pendant 10 minutes pour décolorer et fixer les plasmocytes. Rincez la lame à l’eau désionisée et séchez-la à l’air à température ambiante.
Préchauffer un pot contenant deux fois le tampon SSC à 56 degrés Celsius au bain-marie. Laver le frottis de moelle osseuse préparé dans le tampon SSC préchauffé deux fois pendant 10 minutes, puis tremper dans de l’eau désionisée à température ambiante. Déshydratez le frottis dans un gradient d’éthanol de 70% 85% et 100% d’éthanol chacun pendant une minute.
Sécher le frottis à l’air pendant 10 minutes. Ajoutez d’abord TP53 sur centromère du mélange de sonde du chromosome 17 à la zone d’hybridation et recouvrez-la d’un couvercle, appuyez doucement sur la pince à épiler fine et pointue pour éliminer les bulles d’air par le dessous. Scellez tous les côtés du couvercle avec du ciment en caoutchouc pour assurer une bonne étanchéité.
Après la solidification du ciment en caoutchouc, la lame a été placée sur une machine automatique FISH, la dénaturation a été effectuée à 78 degrés Celsius pendant cinq minutes, suivie d’une hybridation à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Récupérez la glissière de la machine FISH. Utilisez une pince à épiler fine et pointue pour enlever doucement le ciment en caoutchouc.
Immergez la glissière dans deux fois SSC à température ambiante pendant environ une ou deux minutes pour laver le couvercle. Lavez la glissière dans un tampon de préchauffage de 68 degrés Celsius au bain-marie pendant deux minutes. Lavez les diapositives avec deux fois SSC dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant une minute.
Installez-vous dans l’obscurité pour bien sécher pendant 10 minutes à 10 microlitres de DAPI dans la zone hybridée, couvrez avec un couvercle. Visualisez une lame hybridée à l’aide d’un filtre approprié sur un microscope à fluorescence, utilisez un filtre optique fluorophore bleu monochromatique pour observer l’intensité de fluorescence du noyau cellulaire. Prenez des images de noyau cellulaire sous un ensemble de filtres DAPI.
Le CEP17 a été marqué avec une fluorescence verte. Utilisez un filtre optique fluorophore vert à spectre pour observer l’emplacement du CEP17. Prenez l’image des signaux CEP17 sous le jeu de filtres verts.
Le gène TP53 a été marqué avec une fluorescence orange. Utilisez un filtre optique fluorophore orange à spectre pour observer TP53, prendre l’image des signaux TP53 sous l’ensemble, fusionner ces trois images dans un ensemble et examiner les anomalies numériques. Dans une cellule interphasique normale, deux signaux orange et deux signaux verts sont observés à l’intérieur d’un noyau avec une fluorescence bleue indiquant une paire de chromosomes normaux 17.
Les résultats ont montré la morphologie et la génétique de la moelle osseuse chez un patient atteint de myélome multiple. La figure A a montré que 15% des plasmocytes dans un frottis de moelle osseuse se sont révélés plus gros et plus sombres et nucléaires ainsi que de grandes quantités de cytoplasme que la normale. La figure B montrait une image en échelle de gris représentative par un plasmocyte nucléé dans un frottis de moelle osseuse.
La figure C montrait quatre signaux orange et quatre signaux verts dans un noyau interphasique de plasmocytes suggérant que quatre copies du chromosome 17 étaient localisées dans un noyau. La figure D a montré que le caryogramme chromosomique anormal de ce patient a confirmé deux paires de chromosomes 17 dans un noyau. Les frottis de moelle osseuse sont beaucoup plus faciles à obtenir que les échantillons de moelle osseuse anticoagulants, car l’obtention de moelle osseuse anticoagulée nécessite des procédures complexes pour obtenir le noyau.
En conséquence, nous avons établi une méthode convaincante pour le frottis de moelle osseuse FISH pour la détection des cellules myélomateuses multiples.
