Notre protocole permet aux chercheurs de sonder le métabolisme énergétique mitochondrial et les sphéroïdes sans soudure pour permettre des comparaisons entre plusieurs lignées cellulaires, nombres de cellules et phénotypes différents, ainsi que des traitements médicamenteux dans un domaine de la découverte de médicaments et de la recherche sur le cancer. Notre travail présente un protocole détaillé pour explorer le métabolisme énergétique mitochondrial en utilisant des sphéroïdes 3D fournissant le modèle physiologique supérieur par rapport aux expériences de monocouche cellulaire. Les observations biologiques pourraient extrapoler des sphéroïdes vitrés à des tumeurs in vivo et identifier des voies susceptibles de cibler le métabolisme des tumeurs sphéroïdes.
Par exemple, l’utilité des glucides pendant la croissance des sphéroïdes. Toutes les données de l’instrument de flux extracellulaire 96 de l’hippocampe sont très sensibles. Le positionnement des sphéroïdes in vitro dans la plaque d’essai est primordial pour obtenir des données précises au niveau du sphéroïde unique.
Vérifiez la viabilité des sphéroïdes à l’aide d’un microscope à lumière inversée avec contraste de phase à un grossissement de 4x pour assurer une structure sphéroïde intacte, une morphologie et une uniformité globale entre les échantillons. Pour hydrater la cartouche du capteur, aliquotez environ 20 millilitres du calibrant dans un tube conique. Placez le tube conique contenant l’étrier dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant la nuit.
Retirez le contenu du kit d’essai. Placez la cartouche du capteur à l’envers à côté de la plaque utilitaire. Pipette 200 microlitres d’eau stérile double distillée dans chaque puits de la plaque utilitaire à l’aide d’une pipette P300 multicanal.
Placez la cartouche du capteur sur le dessus de la plaque utilitaire. Vérifiez si le niveau d’eau dans chaque puits est suffisamment élevé pour submerger les sondes du capteur. Transférez la cartouche de capteur assemblée dans un incubateur sans dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius et laissez-la toute la nuit.
Pour recouvrir la microplaque de dosage des sphéroïdes, ajoutez 30 microlitres de solution stérile de 0,1 milligramme par millilitre de poly-D-lysine par puits de microplaque sphéroïde à l’aide d’une technique septique. Aspirer la solution de chaque puits de la microplaque sphéroïde, inverser la plaque et la tapoter fermement sur le papier de soie pour éliminer toute solution résiduelle. Lavez chaque puits de la plaque avec 200 microlitres d’eau stérile double distillée.
Après le lavage final, inverser la microplaque et la tapoter fermement sur du papier de soie pour éliminer toute eau résiduelle. Laissez la plaque sécher à l’air libre pendant 30 minutes avant une utilisation future. Préparez le support XF RPMI comme décrit dans le manuscrit.
Préwarmez le milieu de dosage XF RPMI supplémenté à 37 degrés Celsius une heure avant le test. Et préchauffer la microplaque de dosage sphéroïde enduite dans un incubateur non dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius. Retirez le tube conique contenant l’étrier et la cartouche du capteur de l’incubateur à air.
Retirez la cartouche du capteur de la plaque utilitaire et placez-la à l’envers sur la surface de travail. À l’aide d’une pipette multicanal P300, aspirez l’eau de la plaque électrique et jetez-la. Ajouter 200 microlitres de calibrant préavertissé à chaque puits de la plaque utilitaire.
Placez la cartouche du capteur sur la plaque d’utilité en vous assurant que les capteurs sont bien immergés dans l’étrier. Transférez la cartouche de capteur assemblée dans l’incubateur à 37 degrés Celsius non dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elle soit prête à charger les solutions d’injection de port. Sortez la plaque de culture sphéroïde de l’incubateur et observez les sphéroïdes au microscope pour assurer leur intégrité avant les étapes de transfert sphéroïde.
Chargez 180 microlitres de milieu d’essai préchaud dans chaque puits de la plaque sphéroïde, y compris les puits de correction de fond. Remplissez partiellement une boîte de Petri de sept centimètres avec trois millilitres du milieu d’essai. Transférez les sphéroïdes de la plaque de culture de 96 puits dans une boîte de Pétri, à l’aide d’une pipette multicanal chargée de larges pointes de pipette à orifice et d’un volume réglé sur 10 à 50 microlitres.
Réglez le volume d’un pipetteur à canal unique équipé d’une large pointe de pipette à orifice sur 20 microlitres et aspirez soigneusement un seul sphéroïde. Placez la pointe directement au centre de chaque puits de cette microplaque de dosage sphéroïde et laissez l’action capillaire retirer le sphéroïde de la pointe de la pipette. Confirmez l’évolution au microscope en pipetachant le contenu du pipetteur dans la boîte de Pétri.
Une fois que tous ces sphéroïdes ont été transférés sur la microplaque d’essai sphéroïde, transférez la plaque dans un incubateur sans dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant au moins une heure. Préparer les concentrations de stock de travail de chaque composé comme décrit dans le manuscrit, en utilisant un milieu de dosage XF RPMI préavertissé entièrement complété. Distribution de 20 microlitres de la solution de travail de chaque composé dans tous les ports correspondants à l’aide d’une pipette multicanal P100 étalonnée.
Préparez l’analyseur pour le chargement de la cartouche du capteur. Pour obtenir des sphéroïdes compacts bien formés, chaque lignée cellulaire a été optimisée individuellement pour la densité d’ensemencement et la durée de culture. Lors de stratégies d’ensemencement optimisées, le volume de sphéroïdes pour SK-OV-3 était d’environ 5,46 x 10 aux sept micromètres cubes et pour A549, il était de 1,45 x 10 à huit micromètres cubes.
Tous les types de sphéroïdes avaient une corrélation linéaire entre la densité d’ensemencement initiale et le volume de sphéroïdes. La symétrie sphéroïde parfaite avait une circularité de 1,0 et un écart par rapport à 1,0 indiquait une perte de circularité. Pour tous les types de sphéroïdes, le taux de consommation d’oxygène augmentait avec la taille des sphéroïdes et était linéairement corrélé au volume de sphéroïdes avec le plus élevé dans les sphéroïdes MCF-7 et le plus faible dans les sphéroïdes SK-OV-3.
Les sphéroïdes MCF-7 n’ont pas répondu au contrôle du véhicule tout au long de l’expérience. Le taux de consommation d’oxygène dans les sphéroïdes MCF-7 a été réduit avec l’oligomycine après cinq cycles de mesure suivant la première injection de 0,5 microgramme par millilitre. En réponse à BAM15, le taux de consommation d’oxygène a été augmenté avant la deuxième injection.
Alors que la combinaison de roténone et d’antimycine A l’a abaissé. Un protocole pour sonder avec précision la respiration mitochondriale basale. La respiration par phosphorylation ADP, la respiration par fuite, l’efficacité du couplage, la capacité respiratoire maximale et la capacité respiratoire de rechange ont été développées à l’aide de sphéroïdes 3D dérivés du cancer.
Tous les composés respiratoires ont donné les profils de taux de consommation cinétique d’oxygène attendus pour les composés sélectionnés, révélant un taux de respiration basale stable moyen de 20 à 30 picomoles d’oxygène par minute et par puits. Emplacement des sphéroïdes dans la microplaque et numéro de cycle de mesure après l’injection de composé pour assurer la stabilité des taux de respiration entre les ajouts de composés. Lors de l’exploration de la capacité respiratoire mitochondriale avec des découpleurs, non seulement la concentration est essentielle, mais aussi sa capacité à découpler la respiration en présence d’oligomycine, qui est généralement ajoutée avant le découpleur dans les expériences sondant le métabolisme énergétique mitochondrial.
