Наш протокол позволяет исследователям исследовать энергетический метаболизм митохондрий и бесшовные сфероиды, чтобы можно было проводить сравнения между несколькими различными клеточными линиями, номерами клеток и фенотипами, а также лекарственными препаратами в полевых исследованиях лекарств и исследований рака. В нашей работе представлен подробный протокол для изучения митохондриального энергетического метаболизма с использованием 3D-сфероидов, обеспечивающих превосходную физиологическую модель по сравнению с экспериментами с клеточными монослоями. Биологические наблюдения могут быть экстраполированы от сфероидов стекловидного тела к опухолям in vivo и выявлению путей, которые могут быть нацелены на метаболизм сфероидной опухоли.
Например, углеводная полезность во время роста сфероидов. Все данные морского конька внеклеточного потока прибора 96 очень чувствительны. Позиционирование сфероидов in vitro внутри пробирной пластины имеет первостепенное значение для получения точных данных на уровне одного сфероида.
Проверьте жизнеспособность сфероида с помощью инвертированного светового микроскопа с фазовым контрастом при 4-кратном увеличении, чтобы обеспечить неповрежденную сфероидную структуру, морфологию и общую однородность между образцами. Чтобы увлажнить картридж датчика, аликвотируйте примерно 20 миллилитров калибранта в коническую трубку. Поместите коническую трубку, содержащую калибрант, в инкубатор без углекислого газа 37 градусов цельсия на ночь.
Извлеките содержимое набора для анализа. Поместите картридж датчика вверх ногами рядом с полезной пластиной. Пипетка 200 микролитров стерильной двойной дистиллированной воды в каждую скважину полезной пластины с использованием многоканальной пипетки P300.
Поместите картридж датчика поверх вспомогательной пластины. Проверьте, достаточно ли высок уровень воды в каждой скважине, чтобы погрузить датчики. Перенесите собранный картридж датчика в инкубатор без углекислого газа 37 градусов Цельсия и оставьте на ночь.
Чтобы покрыть микропластину сфероидного анализа, добавьте 30 микролитров стерильных 0,1 миллиграмма на миллилитр раствора поли-D-лизина на лунку сфероидной микропластины с использованием септической техники. Аспирируйте раствор из каждой лунки сфероидной микропластины, переверните пластину и плотно постучите ее по папиросной бумаге, чтобы удалить любой остаточный раствор. Вымойте каждую лунку тарелки 200 микролитрами стерильной двойной дистиллированной воды.
После окончательной стирки переверните микропластинку и плотно постучите ее на папиросную бумагу, чтобы удалить остаточную воду. Дайте пластине высохнуть на воздухе в течение 30 минут перед будущим использованием. Подготовьте носитель XF RPMI, как описано в рукописи.
Предварительно прогрейте добавленную XF RPMI пробирную среду до 37 градусов Цельсия за час до анализа. А предварительно прогрейте микропластинку сфероидного анализа с покрытием в инкубаторе без углекислого газа 37 градусов Цельсия. Извлеките коническую трубку, содержащую калибрант и картридж датчика, из воздушного инкубатора.
Извлеките картридж датчика из вспомогательной пластины и поместите его вверх ногами на рабочую поверхность. Используя многоканальную пипетку P300, аспирируйте воду из опорной плиты и выбросьте ее. Добавьте 200 микролитров предварительного калибранта в каждую лунку полезной пластины.
Поместите картридж датчика на полезную пластину, чтобы датчики были хорошо погружены в калибр. Перенесите собранный картридж датчика в инкубатор без углекислого газа, 37 градусов Цельсия до готовности к загрузке растворов для впрыска в порт. Выньте сфероидную культуральную пластинку из инкубатора и понаблюдайте за сфероидами под микроскопом, чтобы убедиться в их целостности перед этапами переноса сфероидов.
Загрузите 180 микролитров предваряемой пробирной среды в каждую скважину сфероидной пластины, включая любые скважины фоновой коррекции. Частично наполните семисантиметровую чашку Петри тремя миллилитрами пробирной среды. Переложите сфероиды с 96-луночной культуральной пластины в чашку Петри, используя многоканальную пипетку, загруженную широкими наконечниками отверстий пипетки, и объем которой составляет от 10 до 50 микролитров.
Установите объем одноканального пипеттера, оснащенного широким наконечником отверстия пипетки, на 20 микролитров и аккуратно аспирируйте один сфероид. Поместите наконечник непосредственно в центр каждой лунки этой микропластины сфероидного анализа и позвольте капиллярному действию вывести сфероид из кончика пипетки. Подтвердите эволюцию под микроскопом, пипетировав обратно содержимое пипетка в чашку Петри.
После того, как все эти сфероиды будут перенесены на микропластину сфероидного анализа, перенесите пластину в инкубатор без углекислого газа 37 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа. Подготовьте концентрации рабочего материала каждого соединения, как описано в рукописи, используя полностью дополненную предварительно обработанную среду для анализа XF RPMI. Дозируется 20 микролитров рабочего раствора каждого соединения во все соответствующие порты с помощью калиброванной многоканальной пипетки P100.
Подготовьте анализатор к загрузке картриджа датчика. Для получения хорошо сформированных компактных сфероидов каждую клеточную линию оптимизировали индивидуально по плотности посева и продолжительности культивирования. При оптимизированных стратегиях посева объем сфероидов для SK-OV-3 составлял около 5,46 x 10 на семь микрометров в кубе, а для A549 он составлял от 1,45 x 10 до восьми микрометров в кубе.
Все типы сфероидов имели линейную корреляцию между начальной плотностью посева и объемом сфероида. Идеальная сфероидная симметрия имела окружность 1,0, а отклонение от 1,0 указывало на потерю циркулярности. Для всех типов сфероидов скорость потребления кислорода увеличивалась с размером сфероида и линейно коррелировала с объемом сфероидов с самым высоким в сфероидах MCF-7 и самым низким в сфероидах SK-OV-3.
Сфероиды MCF-7 не реагировали на управление транспортным средством на протяжении всего эксперимента. Норма потребления кислорода в сфероидах MCF-7 была снижена олигомицином после пяти циклов измерения после первой инъекции 0,5 мкг на миллилитр. В ответ на BAM15 норма потребления кислорода была увеличена перед второй инъекцией.
В то время как комбинация Ротенона плюс Антимицин А снизила его. Протокол точного зондирования базального митохондриального дыхания. АдФ-фосфорилирование дыхания, утечковое дыхание, эффективность связи, максимальная дыхательная способность и запасная дыхательная способность были разработаны с использованием 3D-сфероидов, полученных из рака.
Все респираторные соединения дали ожидаемые профили скорости потребления кинетического кислорода для выбранных соединений, показывающие среднюю устойчивую базальную скорость дыхания от 20 до 30 пикомолей кислорода в минуту на лунку. Расположение сфероидов внутри микропластины и номер цикла измерения после инъекции соединения для обеспечения стабильности скорости дыхания между соединениями. При исследовании митохондриальной дыхательной способности с помощью разъединителей ключом является не только концентрация, но и ее способность разъединять дыхание в присутствии олигомицина, который обычно добавляют перед разъединителем в экспериментах, исследующих митохондриальный энергетический метаболизм.
