Protokolümüz, araştırmacıların mitokondriyal enerji metabolizmasını ve dikişsiz sferoidleri araştırmalarına izin vererek, birkaç farklı hücre hattı, hücre sayısı ve fenotipler arasında karşılaştırmalar yapılmasına izin verir. Çalışmamız, hücre tek katmanlı deneylere kıyasla üstün fizyolojik model sağlayan 3D sferoidleri kullanarak mitokondriyal enerji metabolizmasını keşfetmek için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Biyolojik gözlemler, vitreus sferoidlerinden in vivo tümörlere ekstrapolasyon yapabilir ve sferoid tümör metabolizmasını hedef alabilecek yolları tanımlayabilir.
Örneğin, sferoidlerin büyümesi sırasında karbonhidrat faydası. Tüm veriler denizatı hücre dışı akı 96 cihazı çok hassastır. In vitro sferoidlerin tahlil plakası içinde konumlandırılması, tek sferoid seviyesinde doğru veriler elde etmek için çok önemlidir.
Bozulmamış küresel yapı, morfoloji ve numuneler arasında genel homojenlik sağlamak için 4x büyütmede faz kontrastına sahip ters çevrilmiş bir ışık mikroskobu kullanarak küresel canlılığı kontrol edin. Sensör kartuşunu nemlendirmek için, yaklaşık 20 mililitre kalibrantı konik bir tüpe alın. Kalibranı içeren konik tüpü gece boyunca karbondioksit olmayan 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin.
Tahlil kitinin içeriğini çıkarın. Sensör kartuşunu yardımcı plakanın yanına baş aşağı yerleştirin. Pipet Çok kanallı P300 pipet kullanarak yardımcı plakanın her bir kuyucuğuna 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su.
Sensör kartuşunu yardımcı plakanın üzerine yerleştirin. Her bir kuyucuktaki su seviyesinin sensör problarını suya batırmak için yeterince yüksek olup olmadığını kontrol edin. Monte edilmiş sensör kartuşunu karbondioksitsiz 37 santigrat derece inkübatöre aktarın ve gece boyunca bırakın.
Küresel tahlil mikroplakasını kaplamak için, septik bir teknik kullanarak küresel mikroplakanın kuyusu başına mililitre başına 30 mikrolitre steril 0.1 miligram Poli-D-Lizin çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi küresel mikroplakanın her bir oluğundan aspire edin, plakayı ters çevirin ve herhangi bir artık çözeltiyi çıkarmak için doku kağıdına sıkıca dokunun. Plakanın her bir oluğunu 200 mikrolitre steril çift damıtılmış su ile yıkayın.
Son yıkamadan sonra, mikro plakayı ters çevirin ve kalan suyu çıkarmak için kağıt mendile sıkıca dokunun. Gelecekte kullanmadan önce plakanın 30 dakika boyunca hava ile kurumasını bekleyin. XF RPMI ortamını makalede açıklandığı şekilde hazırlayın.
Takviyeli XF RPMI tahlilini testten bir saat önce 37 santigrat dereceye kadar ısıtın. Ve kaplanmış sferoid tahlil mikroplakasını karbondioksit olmayan 37 santigrat derece inkübatörde önceden ısıtın. Kalibrant ve sensör kartuşunu içeren konik tüpü hava inkübatöründen çıkarın.
Sensör kartuşunu yardımcı plakadan çıkarın ve çalışma yüzeyine baş aşağı yerleştirin. P300 çok kanallı pipet kullanarak, suyu yardımcı plakadan aspire edin ve atın. Yardımcı plakanın her bir kuyucuğuna önceden ısıtılmış kalibrantın 200 mikrolitresini ekleyin.
Sensör kartuşunu yardımcı plakaya yerleştirerek sensörlerin kalibrant içine iyice batırılmasını sağlayın. Monte edilmiş sensör kartuşunu, port enjeksiyon çözeltilerini yüklemeye hazır olana kadar karbondioksit olmayan, 37 santigrat derece inkübatöre aktarın. Küresel kültür plakasını inkübatörden çıkarın ve sferoid transfer adımlarından önce bütünlüklerini sağlamak için sferoidleri mikroskop altında gözlemleyin.
Herhangi bir arka plan düzeltme kuyusu da dahil olmak üzere küresel plakanın her bir kuyucuğuna 180 mikrolitre ön sıcak tahlil ortamı yükleyin. Yedi santimetrelik bir Petri kabını kısmen üç mililitre tahlil ortamı ile doldurun. Geniş delikli pipet uçlarıyla yüklü çok kanallı bir pipet kullanarak ve hacmi 10 ila 50 mikrolitreye ayarlanmış bir pipet kullanarak sferoidleri 96 kuyucuklu kültür plakasından Petri kabına aktarın.
Geniş delikli pipet ucuyla donatılmış tek kanallı pipetleyicinin hacmini 20 mikrolitreye ayarlayın ve tek bir sferoidi dikkatlice aspire edin. Ucu doğrudan bu sferoid tahlil mikroplakasının her bir kuyucuğunun ortasına yerleştirin ve kılcal hareketin sferoidi pipet ucundan çekmesine izin verin. Pipetleyicinin içeriğini Petri kabına geri pipetleyerek mikroskop altında evrimi onaylayın.
Tüm bu sferoidler sferoid tahlil mikroplakasına aktarıldıktan sonra, plakayı en az bir saat boyunca karbondioksitsiz 37 santigrat derece inkübatöre aktarın. Her bir bileşiğin çalışma stok konsantrasyonlarını, makalede açıklandığı gibi, tamamen desteklenmiş önceden ısıtılmış bir XF RPMI tahlil ortamı kullanarak hazırlayın. Her bileşiğin 20 mikrolitrelik çalışma çözeltisi, kalibre edilmiş bir P100 çok kanallı pipet kullanılarak ilgili tüm portlara dağıtıldı.
Analizörü sensör kartuşunu yüklemek üzere hazırlayın. İyi biçimlendirilmiş kompakt sferoidler elde etmek için, her hücre hattı tohumlama yoğunluğu ve ekim süresi için ayrı ayrı optimize edilmiştir. Optimize edilmiş tohumlama stratejilerinde, SK-OV-3 için küresel hacim, küp küp yedi mikrometreye 5.46 x 10 civarında ve A549 için 1.45 x 10 ila sekiz mikrometre küp idi.
Tüm sferoid tipleri, ilk tohumlama yoğunluğu ile küresel hacim arasında doğrusal bir korelasyona sahipti. Mükemmel küresel simetri 1.0'lık bir daireselliğe sahipti ve 1.0'dan sapma dairesellik kaybına işaret ediyordu. Tüm sferoid tipleri için, oksijen tüketim hızı sferoid boyutla artmıştır ve MCF-7 sferoidlerinde en yüksek ve SK-OV-3 sferoidlerinde en düşük olan sferoid hacimle doğrusal olarak korelasyon göstermiştir.
MCF-7 sferoidleri, deney boyunca araç kontrolüne cevap vermedi. MCF-7 sferoidlerindeki oksijen tüketim hızı, mililitre başına 0.5 mikrogramlık ilk enjeksiyonu takiben beş ölçüm döngüsünden sonra oligomisin ile düşürüldü. BAM15'e yanıt olarak, ikinci enjeksiyondan önce oksijen tüketim oranı arttırıldı.
Oysa Rotenon artı Antimisin A kombinasyonu onu düşürdü. Bazal mitokondriyal solunumu doğru bir şekilde araştırmak için bir protokol. ADP fosforilasyon solunum, Kaçak solunum, kuplaj verimliliği, maksimum solunum kapasitesi ve yedek solunum kapasitesi kanser kaynaklı 3D sferoidler kullanılarak geliştirilmiştir.
Tüm solunum bileşikleri, seçilen bileşikler için beklenen kinetik oksijen tüketim hızı profillerini verdi ve kuyu başına dakikada ortalama 20 ila 30 pikomol oksijen oksijen sabit bazal solunum hızı ortaya çıkardı. Sferoidlerin mikroplaka içindeki yeri ve bileşik enjeksiyonu takiben ölçüm döngüsü numarası, solunum hızlarının bileşik ilaveler arasında sabit olmasını sağlar. Birleştiriciler ile mitokondriyal solunum kapasitesini araştırırken, sadece konsantrasyon anahtarı değil, aynı zamanda mitokondriyal enerji metabolizmasını araştıran deneylerde tipik olarak unkuplörden önce eklenen oligomisin varlığında solunumu ayırma kabiliyetidir.
