Mon laboratoire s’intéresse donc à la compréhension de la façon dont l’œil et le cerveau se développent ensemble. Cette technique nous permet d’étudier comment l’entrée rétinienne influence la croissance et le développement du cerveau. L’ablation chirurgicale d’un œil du poisson-zèbre larvaire vivant, suivie de l’observation du tectum optique, nous permet de comparer les lobes tectaux innervés et dénervés chez le même animal et entre les animaux.
La combinaison de cette technique avec des approches moléculaires modernes peut donner un nouvel aperçu des mécanismes sous-jacents au développement neuronal, à la régénération et à la dégénérescence. Pour commencer, connectez les fils de cathode et d’anode à l’alimentation. Fixez le clip d’alligator à l’extrémité du fil cathodique à un trombone partiellement redressé et insérez le trombone dans la solution d’hydroxyde de potassium, en le fixant sur le côté du pot.
Fixez le clip alligator du fil d’anode au cou du porte-aiguille. Tournez la puissance à environ 20 volts et trempez le fil de tungstène dans la solution d’hydroxyde de potassium, en tirant le fil hors de la solution à un angle pour aiguiser électrolytiquement le fil en une pointe fine. Vérifiez la pointe de l’aiguille sous le microscope à dissection pour vous assurer qu’elle est suffisamment nette.
La pointe de l’aiguille courbe se produit lorsque l’aiguille pointue est pliée en la touchant doucement à la boîte de Pétri. Le jour de la chirurgie, utilisez une pipette de pâturage en verre de large trou pour transférer 10 à 15 larves dans une boîte de Petri de 35 millimètres remplie d’E3 frais. Ajouter trois à cinq gouttes d’anesthésique à la larve. Pour déterminer si les larves sont correctement anesthésiées, recherchez l’absence de réponse au toucher.
Ajouter deux à trois gouttes supplémentaires de l’anesthésique si les larves sont toujours sensibles au toucher après trois minutes et réévaluer. Pour immobiliser la larve pour la chirurgie, emmenez une larve dans une pipette de pâturage en verre de forage étroit avec seulement une petite quantité d’E3. Ensuite, prenez environ 200 microlitres de point de fusion fondu à 1% de point de fusion bas ou d’agarose LMP dans la pipette contenant la larve et mélangez pour vous assurer que la larve est en suspension dans l’agarose LMP. Placez le couvercle d’une boîte de Petri de 35 millimètres face vers le haut sous le microscope à disséquer, puis versez la larve et l’agarose sur le couvercle de la boîte de Petri à l’envers.
Étalez l’agarose de sorte que la larve soit au centre de la goutte. À l’aide d’une aiguille en tungstène terne, manœuvrez rapidement mais doucement la larve de sorte qu’elle soit latérale avec un œil tourné vers le haut. Attendez plusieurs minutes que l’agarose se fixe.
En suivant le bord de l’orbite de l’œil, utilisez la pointe d’une fine aiguille de tungstène aiguisée électrolytiquement pour percer la peau autour de l’œil. Ensuite, faites glisser le bord de l’aiguille sous l’œil du côté temporal-ventral de l’œil. Utilisez une pression contrôlée pour libérer l’œil de l’orbite.
Continuez à appuyer sur l’œil dorsalement et antérieurement avec le côté de l’aiguille, pour éventuellement trancher à travers le nerf optique et libérer l’œil. Alternativement, vous pouvez utiliser des pinces chirurgicales très fines pour enlever l’œil en pinçant le nerf optique et en poussant l’œil de médial à latéral. Après un retrait oculaire réussi, couvrez l’agarose avec une solution RRO, libérez chaque larve de l’agarose en brossant doucement une aiguille de tungstène autour de leur tête puis autour de leur corps, tout en stabilisant le couvercle de la boîte de Petri avec des pinces.
Après les chirurgies, placez la larve dans une solution ROR complétée par des antibiotiques jusqu’au lendemain, puis ramenez la larve à E3 et élevez-la jusqu’au point final de l’expérience. Une fois que les larves sont anesthésiées en phase terminale, fixez-les avec 4% de paraformaldéhyde. Suspendez les larves fixes dans les gouttelettes de PBS sur une plaque de protection sous un microscope à dissection.
Fixez-les latéralement en plaçant deux broches en tungstène à travers la notochorde avec une broche postérieure à la zone pigmentée couvrant la région AGM et une autre alignée avec l’extrémité de l’extension du jaune. Retirez l’œil avec une aiguille en tungstène pointue et une pince fine. Parfois, il est possible de percer l’aiguille à travers la mâchoire du côté opposé et d’enlever l’autre œil.
Utilisez l’aiguille en tungstène pour gratter du côté temporal au côté ventral de l’oreille. Dans la même action en mouvement, amenez l’aiguille postérieure à la mâchoire et tirez doucement vers l’avant jusqu’à ce que l’oreille et la mâchoire soient enlevées. Retirez l’autre œil et l’oreille en piquant l’aiguille à travers la mâchoire.
Utilisez des pinces pour retirer les organes ventraux et le jaune restant. Enfin, faites une incision peu profonde dans la peau crânienne dorsale près de la jonction entre le cerveau postérieur et la moelle épinière. Soulevez la peau avec la pince et tirez-la vers l’avant et autour du télencéphale.
Retirez tout tissu restant avec une pince. Détachez la larve et transférez-la dans pbS dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Fixez une glissière chambrée dans le couvercle d’une boîte de Petri de 100 millimètres avec de la graisse sous vide.
Transférez la larve immunocolorée et traitée sur une plaque de puits ou une lame de dépression pour les voir avec un microscope à dissection. Montez la larve sur la lame chambrée dans des colonnes d’agarose 1%LMP. À l’aide d’un verre passé devant votre pipette, placez une larve sur la lame chambrée, en déposant le moins de PBS possible.
Couvrir la larve avec de l’agarose LMP fondue et chaude à 1% à l’aide de la même pipette. Pipettez l’agarose LMP dans une colonne, puis positionnez la larve aussi symétriquement que possible avec la surface dorsale visible. Après l’ablation des yeux, une dégénérescence progressive des axones rétiniens a été observée dans le neuropil du tectum optique.
Deux jours après la chirurgie, les axones étiquetés RFP présentaient des caractéristiques de dégénérescence wallérienne rapide, telles que le blabla et la fragmentation. Des ponctuations positives à la DP ont été notées à l’intérieur et à l’extérieur du neuropil sur le côté droit du tectum, comme l’indiquent les flèches. Quatre jours après la chirurgie, les axones fragmentés et les débris axonaux marqués RFP ont été considérablement réduits dans le lobe tectal droit, ce qui indique une clairance relativement rapide des axones mourants et dégénérés.
Le cerveau a été exposé en disséquant les yeux, la mâchoire, les oreilles et la calotte crânienne de la peau et des tissus conjonctifs. Idéalement, le cerveau reste intact pendant cette procédure. Cependant, certaines parties du cerveau antérieur, en particulier le bulbe olfactif, ont probablement été endommagées ou complètement enlevées lorsque la calotte crânienne de la peau ou de la mâchoire a été enlevée.
De plus, parfois, le rebord latéral du tectum est tranché lors du perçage ou du pincement de la peau pour l’arracher du cerveau. Il n’y a pas deux échantillons identiques. Vous devez donc être capable de faire des adaptations subtiles par l’ablation des yeux et la dissection cérébrale au besoin.
Les patients et les outils pointus sont essentiels au succès. Cette technique peut être suivie d’approches cellulaires et moléculaires, comme l’imagerie in vivo de cellules vivantes ou le séquençage de l’ARN pour acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires et cellulaires de la croissance et du développement du tectum optique.
