Ces protocoles permettent la quantification de la résolution d’une cellule unique, la co-expression de marqueurs et une analyse spéciale à l’aide d’échantillons de tissus frais et fixés au formol et incorporés à la paraffine pour élucider les rôles des cellules immunitaires dans le cancer. Cette technique est un outil puissant qui facilite la caractérisation simultanée d’un marqueur 40 sur une seule coupe de tissu, préservant largement la structure du tissu dans les échantillons. L’étape critique est l’optimisation et la validation des anticorps.
L’échec de l’étape peut entraîner des images de mauvaise qualité qui peuvent compromettre la conservation de données et de résultats reproductibles de haute qualité. Commencez par faire tourner tous les tubes contenant des anticorps à 10 000 x G pendant cinq minutes, ajoutez des anticorps individuels au tampon bloquant et mélangez bien. Ne pas déranger le fond du tube d’anticorps lorsque vous le pipetez.
Filtrer le panneau d’anticorps en pré-mouillant un dispositif de filtration centrifuge de 0,1 micromètre avec 100 microlitres de tampon de blocage. Faites tourner le filtre à 10 000 x G pendant deux minutes et retirez le tampon de blocage à l’aide d’une pipette. Ensuite, transférez le panneau d’anticorps dans une colonne de rotation et faites tourner le filtre à 10 000 x G pendant deux minutes.
Jetez la colonne de rotation et utilisez le flux continu comme panneau d’anticorps filtrés. Pour la coloration des anticorps, retirez le tampon de blocage des lames en basculant chaque lame sur le côté et en tapotant doucement les bords contre un essuie-glace. Placez les lames dans une chambre d’humidité et ajoutez 100 à 200 microlitres de mélange principal d’anticorps dans le tissu.
Ajouter des lames de contrôle positif et négatif au lot de coloration et incuber les lames à 4 degrés Celsius pendant la nuit. Pour configurer l’instrument, connectez-vous au logiciel de contrôle et cliquez sur Réveil, si l’instrument est en mode veille. Cliquez sur Exemple d’échange pour charger une diapositive, puis cliquez sur Continuer pour ouvrir la porte.
Placez la lame dans la fente de chargement avec un échantillon vers le haut et l’étiquette à droite, cliquez sur Continuer pour fermer la porte. Sélectionnez le projet, puis sélectionnez le nom de la diapositive pour l’exemple chargé. Visualisez l’image panoramique sur le volet d’image optique de la diapositive pour le champ de vision ou la sélection du champ de vision, cliquez sur le menu Mode et sélectionnez Détecteur d’électrons secondaire, puis cliquez sur le menu Mode d’imagerie et choisissez QC 300 micromètres.
Cliquez sur Jog Stage pour contrôler l’emplacement du champ de vision, puis cliquez sur les flèches pour naviguer et sélectionner la position du FOV. Cliquez sur ajouter un champ de vision, définissez 400 micromètres par 400 micromètres comme taille de champ et sélectionnez Fine comme mode d’imagerie et 1 milliseconde de temps d’arrêt, cliquez sur Confirmer. Après avoir créé une liste de champ de vision, passez à la mise au point de l’image et ajustez la stigmatisation en déplaçant le faisceau vers une région tissulaire qui ne sera pas imagée.
Ajustez les paramètres jusqu’à ce qu’une image centrale claire soit obtenue, cliquez sur Démarrer l’exécution. Les images acquises seront automatiquement téléchargées et stockées dans l’application Web de gestion des images. La matrice illustrée ici décrit le pourcentage de diaphonie dérivé de la pureté de la sonde et des oxydes.
Ici, les cases bleues indiquent une diaphonie supérieure ou égale à 0,5 % et les cases claires indiquent une diaphonie inférieure à 0,5 %. Pour les balises de masse, les sondes qui ont contribué à au moins 0,5 % de diaphonie dans aucun canal, un ou deux canaux, ou plus de deux canaux sont affichées ici. Les canaux de masse recevant au moins 0,5 % de diaphonie provenant de l’absence de sondes, d’une ou deux sondes ou de plus de deux sondes sont également affichés.
Les images de coloration représentatives dans différents tissus comme l’adénocarcinome pulmonaire, le rein non néoplasique et l’amygdale sont représentées ici. Une image d’une coupe de tissu d’amygdale colorée à l’aide de cette technique et visualisée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images numériques tiers avant le filtrage et la correction est présentée ici. L’image de la même section dans les mêmes conditions après les étapes de filtrage et de correction est montrée ici.
Cette méthode génère des images qui peuvent être téléchargées sur un logiciel d’analyse d’images numériques tiers, permettant une analyse complète telle que la compartimentation des tissus, la segmentation cellulaire, la co-expression de marqueurs, ainsi que l’analyse des voisins et l’analyse à distance. Des méthodes d’imagerie hautement multiplex sont disponibles grâce à la recherche. En construisant différents panels, les chercheurs peuvent étudier des échantillons cancéreux, normaux, paranéoplasiques, inflammatoires et infectieux.
